肥头鲦血红素加氧酶-1（HO-1）基因的克隆与表达研究

论文摘要

血红素加氧酶（heme oxygenase, HO）是血红素代谢的限速酶。HO-1也称热休克蛋白32（Heat shock protein32, HSP32）,能够抗氧化、抗凋亡、抗炎症、抗增殖等,具有细胞保护作用。越来越多的研究亦显示HO-1可拮抗微生物感染,且在病毒感染中可能也具有保护作用。目前有关HO-1与病毒感染的相关研究主要集中于哺乳动物。为了研究病毒感染对鱼类HO-1表达的影响,以及鱼类HO-1在病毒感染中的作用,从而提供可能的病毒性疾病的治疗新方法,本研究以鲤鱼上皮瘤细胞（Epithelioma Papulosum Cyprini,简称EPC）为实验材料,克隆得到肥头鲦HO-1基因的cDNA全序列,进一步从细胞水平上探讨了鲤春病毒血症病毒（SVCV）感染及钴原卟啉（CoPP）对肥头鲦（Pimephales promelas） HO-1基因表达的影响,主要结论如下：1.肥头鲦HO-1基因cDNA的克隆及系统进化分析利用RT-PCR及RACE法从EPC细胞中克隆得到肥头鲦HO-1cDNA。该序列全长为1110bp,5’端非翻译区为52bp,3’端非翻译区为203bp,3’非编码区含有多聚A加尾信号（AATAAA）、RNA不稳定序列（ATTTA）,其开放阅读框（ORF）为858bp,编码285AA。功能预测显示其含有一个血红素加氧酶特征序列（AA129-152）和跨膜区（AA264-285）。氨基酸序列分析表明,肥头鲦HO-1与哺乳动物、鸟类及其他鱼类的HO-1同源,与鱼类的同源性较高（58.8%-72.7%）,且与斑点叉尾鮰和蓝鲶的同源性最高,分别为72.4%和72.7%,与人、鼠、鸡的同源性较低,分别为44.1%、44.1%,45.4%。2SVCV感染对肥头鲦HO-1表达的影响研究利用RT-PCR及Real-TimePCR技术在细胞水平上研究SVCV感染对HO-1的表达影响时发现,在1MOI感染条件下,同对照组比较,HO-1的表达水平在感染3小时即下降,在感染6小时后达到最低值,进而有缓慢的升高,但仍低于对照组。在0.1MOI感染条件下,同对照组比较,HO-1的表达水平在感染后6小时开始下降,在12小时至最低值,至24小时有缓慢的上升,但仍低于对照组,结果说明SVCV感染能抑制HO-1的表达。3.钴原卟啉（CoPP）对肥头鲦HO-1的诱导表达研究以不同浓度的钴原卟啉（CoPP）对EPC细胞进行处理,运用半定量RT-PCR技术检测肥头鲦HO-1基因的表达情况,结果显示CoPP不能诱导HO-1表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 縮略词表
• 第一章 文献综述
• 1 血红素加氧酶简介
• 1.1 血红素加氧酶
• 1.2 血红素加氧酶基因
• 1.3 血红素加氧酶的组织分布
• 2 HO-1与病毒相关性研究
• 2.1 病毒感染对HO-1表达的影响
• 2.2 HO-1表达对病毒感染的影响
• 2.3 HO-1抑制病毒感染的机理
• 3 鱼类HO-1的相关研究
• 4 鲤春病毒血症病毒简介
• 5 目的与意义
• 第二章 肥头鲦HO-1基因cDNA克隆与系统进化分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 细胞、菌株和载体
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 EPC细胞复苏及传代培养
• 1.2.2 肥头鲦HO-1基因cDNA核心片段的克隆
• 1.2.3 HO-1基因cDNA 3’末端的克隆
• 1.2.4 HO-1基因cDNA 5’末端的克隆
• 1.2.5 HO-1基因序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 肥头鲦HO-1基因cDNA核心片段的克隆和序列测定
• 2.2 肥头鲦HO-1基因cDNA 3’末端的克隆和序列测定
• 2.3 肥头鲦HO-1基因cDNA 5’末端的克隆和序列测定
• 2.4 肥头鲦HO-1基因cDNA全序列分析
• 2.5 肥头鲦与其他生物HO-1氨基酸序列同源性比较及系统进化分析
• 3 讨论
• 4. 小结
• 第三章 SVCV感染对HO-1表达的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 细胞和病毒
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 病毒感染
• 1.2.2 RNA提取
• 1.2.3 反转录
• 1.2.4 半定量PCR检测SVCV-G mRNA的表达
• 1.2.5 Real-Time PCR检测感染后不同时间点的肥头鲦HO-1 mRNA的表达情况
• 2 结果与分析
• 2.1 半定量PCR检测SVCV-G基因的表达
• 2.2 Real-Time PCR检测SVCV感染后不同时间点的HO-1 mRNA的表达情况
• 3 讨论
• 4. 小结
• 第四章 CoPP对HO-1表达的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 细胞
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 CoPP处理EPC细胞
• 1.2.2 半定量RT-PCR检测HO-1 mRNA表达情况
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4. 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附表Ⅰ：试验中试剂的配置方法
• 附表Ⅱ：硕士期间发表的论文