紫贻贝（Mytilus edulis Linnaeus）多糖的提取分离及结构研究

论文摘要

紫贻贝（Mytilus edulis Linnaeus）俗称海虹,属软体动物门,广泛分布于我国辽宁、山东、浙江等省沿海。紫贻贝资源丰富,肉味鲜美,营养价值高,素有“海洋鸡蛋”之称,并且紫贻贝多糖具有抗凝血、抗肿瘤、免疫功能调节等生物活性。本文以来源于青岛湖岛海域的紫贻贝为原料,采用不同的方法提取得到紫贻贝粗多糖,对它们的基本理化性质进行了较为系统的分析,并采用凝胶渗透和阴离子交换柱层析进行两步纯化,得到了多个具有较高纯度的多糖组分。通过多种化学分析及现代仪器分析技术,确定了60℃热水提取（HW）多糖组分（HWS）的结构,并对酶提（MT）多糖组分（MT0-A1）的结构进行了初步研究。采用冷水、60℃热水、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶联合酶解提取紫贻贝粗多糖,并对冷水提粗多糖（LT）、HW粗多糖、MT粗多糖进行理化性质分析。PMP柱前衍生高效液相色谱法测得LT和HW单糖组成较简单,主要是葡萄糖（Glc）。MT的单糖组成比较复杂,主要含有Glc、氨基葡萄糖（GlcN）、甘露糖（Man）、氨基半乳糖（GalN）、半乳糖（Gal）和岩藻糖（Fuc）。对LT和MT分别采用Q Sepharose 4 Fast Flow离子交换柱层析、Sepharcryl S300和SephadexTM G-25 Fine凝胶排阻柱层析进一步纯化,得到了LTS1-A1、LTS1-B、LTS2-B1、LTS2-B2、MT0-A1和MT1-B1具有较高纯度的多糖组分,高效凝胶色谱图显示色谱峰单一、对称,重均相对分子质量分别为31.8、40.7、48.1、47.4、3.9和4.8 kD。LTS1-A1的单糖组成较简单,主要由Glc组成;LTS1-B主要含有Man、GlcN、GalN、Glc、Gal和Fuc;LTS2-B1、LTS2-B2、MT0-A1和MT1-B1的单糖组成相似,主要由Man、GlcN、GalN、Gal和Fuc组成。HW经Sepharcryl S300凝胶层析分离得到一种具有较高纯度的多糖组分HWS,总糖含量为98.5%,蛋白含量1.1%,相对分子质量为574.5 kD。在对其基本理化性质进行研究的基础上,对HWS采用甲基化和气质联用（GC/MS）分析、高碘酸氧化和Smith降解、红外光谱（FT-IR）、核磁共振（NMR）技术对其结构进行了深入研究,证实HWS是以（1→4）-α-D-Glcp为主链,含有少量的→2,4)-Glcp-（1→和→6）-β-Glc（1→分支的葡聚糖,平均每6个主链糖残基含有1个分支。采用甲基化和GC/MS分析、FT-IR、2D NMR技术对MT0-A1的结构进行了初步研究,结果表明:MT0-A1主要含有→3）-β-D-GlcNAcp-（1→;α-L-Fucp-（1→和→3）-α-L-Fucp;→2）-α-D-Galp-（1→;→3）-α-D-Manp-（1→和→4）-α-D- GalNAcp- (1→等结构单元。虽然紫贻贝多糖理化性质和生物活性的初步研究已有报道,但有关紫贻贝多糖较为系统的理化性质、分离纯化和结构方面的研究报道尚不多见。本文对7种具有较高纯度的多糖组分进行了理化性质分析,并对HWS和MT0-A1的结构与组成进行了较系统的研究,为紫贻贝多糖的进一步研究与开发和生物活性的深入研究提供了参考和借鉴。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 多糖
• 1.1 海洋生物多糖
• 1.1.1 海洋微生物多糖
• 1.1.2 海藻多糖
• 2 海洋动物多糖研究进展
• 2.1 海洋动物多糖的提取
• 2.2 海洋动物多糖的分离纯化
• 3 贻贝的研究
• 3.1 贻贝的概况
• 3.1.1 贻贝的外部特征
• 3.1.2 贻贝的种类及分布
• 3.1.3 贻贝的生长和繁殖
• 3.2 贻贝的药用价值和营养价值
• 3.3 贻贝多糖的生物活性
• 3.3.1 抗肿瘤
• 3.3.2 抗氧化
• 3.3.3 免疫调节
• 3.3.4 抑制流感病毒
• 3.3.5 抗炎作用
• 3.3.6 抗衰老
• 3.3.7 其他
• 4 紫贻贝和紫贻贝多糖
• 4.1 紫贻贝特征及分布
• 4.2 紫贻贝多糖生物活性
• 5 本课题的立题背景和研究思路
• 第二章 紫贻贝粗多糖的提取和理化性质研究
• 1 材料和仪器
• 2 实验方法
• 2.1 样品的前处理
• 2.2 冷水提取紫贻贝粗多糖
• 2.3 酶法提取紫贻贝粗多糖
• 2.4 60℃热水提取紫贻贝粗多糖
• 2.5 SEVAGE 法脱蛋白
• 2.6 紫贻贝粗多糖的理化性质测定
• 2.6.1 总糖含量测定
• 2.6.2 蛋白含量测定
• 2.6.3 硫酸根含量测定
• 2.6.4 糖醛酸含量测定
• 2.6.5 糖胺聚糖含量测定
• 2.7 相对分子质量测定
• 2.7.1 色谱条件
• 2.7.2 标准曲线制作
• 2.7.3 供试品相对分子质量测定
• 2.8 单糖组成测定
• 2.8.1 溶液的配制
• 2.8.2 供试品的全水解
• 2.8.3 衍生条件
• 2.8.4 色谱条件
• 2.8.5 样品单糖组成测定
• 2.9 DPPH 自由基清除能力测定
• 3 实验结果
• 3.1 紫贻贝粗多糖提取原料的确定
• 3.2 紫贻贝粗多糖的提取结果
• 3.2.1 冷水提取
• 3.2.2 酶法提取
• 3.2.3 热水提取
• 3.3 SEVAGE 法结果
• 3.4 紫贻贝粗多糖理化性质测定结果
• 3.4.1 总糖含量测定结果
• 3.4.2 蛋白含量测定结果
• 3.4.3 硫酸根含量测定结果
• 3.4.4 糖醛酸含量测定结果
• 3.4.5 糖胺聚糖含量测定结果
• 3.4.6 相对分子质量范围测定结果
• 3.4.7 单糖组成测定结果
• 3.5 DPPH 自由基清除能力测定
• 4 本章小结
• 第三章 紫贻贝水提和酶提多糖的分离纯化
• 1 材料和仪器
• 2 实验方法
• 2.1 凝胶柱层析
• 2.2 阴离子交换柱层析
• 2.3 理化性质测定
• 2.3.1 总糖含量测定
• 2.3.2 蛋白含量测定
• 2.3.3 糖醛酸含量测定
• 2.4 纯度及相对分子质量范围测定
• 2.4.1 色谱条件
• 2.4.2 标准曲线制作
• 2.4.3 样品相对分子质量测定
• 2.5 柱前衍生高效液相色谱法测定单糖组成
• 2.5.1 样品的完全酸水解
• 2.5.2 衍生条件
• 2.5.3 色谱条件
• 2.5.4 样品单糖组成测定
• 3 实验结果
• 3.1 LT 粗多糖的分离纯化
• 3.2 MT 粗多糖的分离纯化
• 3.3 六种组分的理化性质测定结果
• 3.3.1 糖含量测定结果
• 3.3.2 蛋白含量测定结果
• 3.3.3 糖醛酸含量测定结果
• 3.4 G25 对五种组分分离纯化
• 3.5 样品纯度及相对分子质量测定结果
• 3.6 单糖组成分析结果
• 4 本章小结
• 第四章 紫贻贝水提多糖 HWS 的理化性质和结构分析
• 1 材料与仪器
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验试剂
• 1.3 实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 凝胶柱层析分离纯化
• 2.2 理化性质分析
• 2.2.1 HWS 的总糖含量测定
• 2.2.2 HWS 的蛋白含量测定
• 2.2.3 单糖组成分析
• 2.2.4 紫外分光光度计全波长扫描
• 2.2.5 相对分子质量及纯度测定
• 2.2.6 碘液显色鉴定
• 2.2.7 α-1,4 淀粉酶水解产物分析
• 2.3 红外光谱（IR）分析
• 2.4 甲基化反应
• 2.5 GC/MS 分析
• 2.6 高碘酸氧化和SMITH 降解
• 2.7 核磁共振（NMR）分析
• 3 实验结果
• 3.1 凝胶柱层析分离纯化结果
• 3.2 理化性质测定结果
• 3.2.1 总糖含量测定结果
• 3.2.2 蛋白含量测定结果
• 3.2.3 单糖组成分析结果
• 3.2.4 紫外分光光度计全波长扫描
• 3.2.5 相对分子质量及纯度测定结果
• 3.2.6 碘液显色分析结果
• 3.2.7 TLC 分析结果
• 3.3 红外光谱分析结果
• 3.4 甲基化分析结果
• 3.5 GC/MS 分析结果
• 3.6 高碘酸氧化和SMITH 降解结果
• 3.7 核磁共振分析结果
• 4 本章小结
• 第五章 紫贻贝酶提多糖 MT0-A1 的结构分析
• 1 材料与仪器
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验试剂
• 1.3 实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 单糖组成分析
• 2.2 相对分子质量及纯度测定
• 2.3 部分酸水解
• 2.4 完全酸水解
• 2.5 IR 分析
• 2.6 甲基化-GC/MS 分析
• 2.7 NMR 分析
• 3 实验结果
• 3.1 单糖组成结果
• 3.2 相对分子质量及纯度测定结果
• 3.3 部分酸水解结果
• 3.4 IR 分析结果
• 3.5 甲基化分析结果
• 3.6 核磁共振分析结果
• 4 本章小结
• 结语
• 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历及参与发表的学术论文