邻苯二甲酸二丁酯对大鼠神经行为发育的影响及机制初探

论文摘要

邻苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate，DBP）是目前用量较大的邻苯二甲酸酯类（Phthalateesters，PAEs）化合物的重要成员，是一种重要的内分泌干扰物。DBP主要用作纤维素树脂、聚氯乙烯、以及橡胶制品的增塑剂、软化剂，同时也是生产油漆、粘接剂、药物制剂等多种工业品的重要原料。在生产过程中，由于DBP并未与这些产品牢固结合，就会从中不断释放进入环境，对人群健康产生危害。据美国NTP估计，一般人群通过各种途径接受DBP的暴露水平为2-10μg／kg体重／天。当DBP进入机体后，可迅速代谢为邻苯二甲酸单丁酯（Mono-butyl phthalate，MBP），后者是DBP引起发育毒性效应的罪魁祸首。目前很多研究表明DBP的危害主要是其生殖和发育毒性。DBP的毒性机制主要源于其对内分泌的干扰作用，体内、体外实验表明DBP具有雌激素和／或抗雄激素的活性，并能影响体内甾体合成的多种酶的活性。然而DBP对神经行为发育的影响目前尚不清楚。中枢神经系统在发育时期对体内多种激素水平的变化非常敏感，若此期间暴露于内分泌干扰物DBP，其发育和功能很可能受到影响。流行病学资料提示DBP具有神经毒性，但由于是多种PAEs的混合暴露，其结果尚具有不确定性。神经行为指标不仅是反映内分泌干扰物对机体作用的敏感指标，也是化合物对多器官系统作用的综合反映。本研究主要从神经行为发育的角度，对DBP的毒性作用及其机制进行初步探讨，以进一步认识DBP的危害。研究以大鼠为对象，通过在妊娠期和哺乳期染毒，采用一系列神经行为测试组合，在多个时间点测试DBP对F1大鼠神经行为发育的影响。多剂量组、大样本、跨代长期染毒是本研究的特点。由于发现DBP可影响子代雄性大鼠的空间学习记忆，机制研究中以其为代表，采用分子生物学方法检测在发育期间不同时间点仔鼠海马中与学习记忆相关的基因和蛋白质的表达，采用电生理的万法检测大鼠海马齿状回的长时程增强（long-term potentiation，LTP）能力的改变，初步探讨DBP对大鼠海马神经细胞的发育和功能的影响，进一步了解DBP的神经毒性作用机制，为DBP污染的防治工作提供重要的实验和理论依据。第一部分DBP对F0雌性大鼠生殖和F1仔鼠生长发育的影响目的：研究DBP对F0雌性大鼠生殖和F1仔鼠生长发育的影响。方法：Wistar妊娠大鼠60只，随机分为对照、低、次低、次高、高5个剂量组，每组11～13只。从GD6起，四个实验组分别喂饲给予质量百分比含量为0.037％、0.111％、0.333％和1％的DBP染毒孕、母鼠及F1仔鼠至PND28，对照组饲料不含DBP。观察孕鼠的体重、进食量、染毒后的一般情况以及生殖情况；观察测量仔鼠的体重变化、早期生理发育指标（体长、尾长、肛殖距、张耳、出牙、开眼）；染毒结束时解剖检查各主要脏器情况并称量计算脏器系数。结果：（1）各实验组孕鼠的进食量和体重随妊娠天数逐渐增加，但与对照组比较，其增量未见明显改变（p＞0.05）。（2）各实验组孕鼠未见明显中毒症状，妊娠失败率、每窝活仔数、窝仔性别比与对照相比无明显差异（p＞0.05），但高剂量组的妊娠期较对照组稍延长（p＜0.05）。（3）高剂量组雌性和雄性仔鼠在PND0～28期间体重明显低于对照组的同性别仔鼠，差异有显著性（p＜0.01）。（4）高剂量且雄性仔鼠的肛殖距（体重立方根标准化）显著降低（p＜0.01），而各剂量组雌性仔鼠肛殖距未见明显改变（p＞0.05）。（5）各实验组仔鼠的张耳、出牙和开眼的天龄与对照组比较无显著差异（p＞0.05）。（6） PND28龄高剂量组仔鼠（雌和雄）肝脏系数显著增加（p＜0.01），高、次高剂量组雌性仔鼠脾脏系数和高剂量组雄性仔鼠睾丸系数显著降低（p＜0.01），各实验组脑、心、肺、肾和子宫脏器系数未见明显改变（p＞0.05）。结论：在本实验的染毒方式、时间和剂量下，未见DBP对F0雌鼠的生殖能力产生明显的毒性作用，但高剂量DBP显著影响F1仔鼠的生长发育并具有明显的脏器毒性，主要表现仔鼠体重减轻、肛殖距（雄）缩短、肝脏脾脏和睾丸的脏器系数的改变。第二部分DBP对F1大鼠神经行为发育的影响目的：研究DBP暴露对F1大鼠神经行为发育的影响。方法：孕鼠、仔鼠的分组染毒同第一部分。在出生后特定的天龄，每窝选择仔鼠进行平面翻正（PND4，7）、负趋地性（PND4，7）、悬崖回避（PND7）、前肢悬挂（PND10）、空中翻正（PND16）等行为功能测试，检测DBP对早期行为发育的影响；选择4周龄仔鼠进行开阔场实验，检测DBP对仔鼠活动度的影响；选择5周龄仔鼠进行Morris水迷宫实验，检测DBP对F1仔鼠学习记忆能力的影响。结果：（1）早期行为发育指标：PND7高剂量组雄性仔鼠平面翻正的评分显著低于对照组，差异有显著性（p＜0.05），高剂量和低剂量组雄性仔鼠PND10前肢悬挂时间较对照组显著降低（p＜0.05），但在PND4的平面翻正以及各时间点的悬崖回避、负趋地性和空中翻正试验中不论是雄性还是雌性仔鼠都未见有显著的影响。（2）开阔场实验：各实验组仔鼠的跨格子数、跨格的分布、后腿站立次数以及停留超过0.5s的次数比较，既无处理效应的差异也无性别效应的差异（p＞0.05），合并性别比较也未见统计学显著的差异（p＞0.05）。（3）Morris水迷宫实验：①在隐蔽平台试验中，性别和训练天数有明显的交互作用（p＜0.01），高剂量组的雄性仔鼠在训练的第3-5天显示比对照组较好的空间学习能力（p＜0.05），但低剂量组雄性仔鼠在训练的第4-5天显示比对照组较差的空间学习能力（p＜0.05）；各实验组雌性仔鼠的学习能力与对照组比较无显著改变。②在空间探索试验中，低剂量组和次低剂量组雄性仔鼠的空间偏好（反映空间记忆）显著低于对照组（p＜0.05）；各实验组雌性仔鼠的空间偏好与对照组比较无显著改变。③可视平台试验：各实验组仔鼠（雄性和雌性）的逃避潜伏期和游泳路程与对照比较差异都无显著性（p＞0.05）。结论：在本实验条件下，DBP显露对F1雄性大鼠的早期神经行为发育以及空间学习记忆有一定的影响，但对F1雌性大鼠的影响却很少，其作用表现出明显的性别著异和非单调的剂量-反应关系。第三部分DBP对雄性仔鼠海马神经细胞发育有关的基因和蛋白质表达的影响目的：研究DBP对雄性大鼠海马神经细胞发育相关的基因和蛋白质表达的影响，探讨DBP的神经毒性作用机制。方法：姬娠Wistar大鼠，随机分为对照、低、次低、次高、高5个剂量组，每组8～10只。自GD6起，每日灌胃给予玉米油（溶剂）、25mg／kg，75 mg／kg、225 mg／kg、675mg／kg的DBP染毒孕、母鼠至PND21；取PND1，7，21雄性仔鼠的海马，用荧光定量RT-PCR检测c-fos、BDNF（all variants）、Spinophilin、PSD95、Synaptophysin、CREST、BDNF variantⅢ等基因的表达；用Western blot检测PND21雄性仔鼠海马BDNF、p-CREB、Spinophilin和芳香化酶蛋白质的表达。结果：（1）对海马基因表达的影响：①与神经细胞生长和分化以及学习记忆密切相关的即早基因：PND21高剂量组BDNF（all variants）基因的相对内参基因GAPDH的表达量较对照增加约30％，差异有显著性（p＜0.01），但各实验组c-fos基因的表达与对照比较无显著变化。②与树突和突触结构和功能相关的基因：PND21低剂量组Spinophilin基因相对表达量较对照组增加35.7％，差异有显著性（p＜0.05），但各实验组PSD95、Synaptophysin表达与对照比较无显著变化。③与CREB信号调控通路相关的基因：各实验组BDNF variantⅢ（尽管高剂量组占总BDNF mRNAs的比例降低）和CREST基因的相对表达量与对照相比无明显变化。（2）对海马蛋白质表达的影响：PND21高剂量组BDNF（成熟蛋白质分子）、Spinophilin和芳香化酶相对内参蛋白GAPDH的表达较对照组均显著增加（分别p＜0.01，p＜0.05和p＜0.01），但各实验组p-CREB蛋白的相对表达量与对照组相比未见明显改变。结论：妊娠期和哺乳期高剂量的DBP暴露可促进雄性仔鼠海马BDNF、Spinophilin和芳香化酶的表达，提示其可能促进海马神经细胞的生长与分化、树突棘增多；高剂量DBP暴露促进BDNF表达的作用与上游CREB的激活调控作用无关；DBP暴露可能不会影响雄性大鼠海马的突触结构和功能。第四部分DBP对雄性大鼠成年后学习记忆以及血清生化指标和海马LTP的影响目的：研究发育期间DBP暴露对雄性大鼠成年后学习记忆的影响，研究DBP长期暴露对雄性大鼠血清生化指标和海马齿状回LTP的影响。方法：第3部分中的剩余雄性大鼠，1只／窝／组，继续以同样的方式和剂量染毒至PND28，在1月龄和2月龄时进行Morris水迷宫实验；保留调剂量组、低剂量组和对照组继续染毒至3月龄，尾尖采血检测生化指标，在体测定海马齿状回LTP。结果：（1）水迷宫实验：与对照组相比，高剂量组雄性仔鼠1月龄时表现出较好的空间学习能力（p＜0.05）；染毒间断至仔鼠2月龄时仍表现出较好的空间学习记忆能力（p＜0.05）。（2）血清生化指标：与对照组相比，高剂量组雄性仔鼠血清白蛋白、总蛋白显著降低，而血清谷草转氨酶（AST）和血清胆碱酯酶（CHE）活性却显著增加（所有p＜0.05）。（3）海马齿状回LTP：各组大鼠海马齿状回LTP诱发的成功率均大于70％、PS增幅和EPSP斜率的增加都在100％左右，但与对照组比较，两个实验组的这3个指标均未见显著性差异（均p＞0.05）。结论：高剂量DBP染毒的雄性大鼠在近成年时仍然表现出较好的学习记忆能力，可能是源于早期DBP对神经系统发育的影响；高剂量DBP长期暴露对成年雄性大鼠有明显的肝脏毒性；DBP长期暴露对雄性大鼠海马齿状回颗粒细胞的突触传递功能影响不明显。综上4个部分研究所述，在本实验的研究条件下，发现高剂量的DBP具有明显的生殖毒性、发育毒性和肝脏毒性。对早期神经行为而言，DBP对雌性仔鼠的影响不明显，但对雄性仔鼠有一定的影响，表现为平面翻正、前肢悬挂等行为功能的异常。然而在高剂量时却促进了雄性仔鼠的空间学习记忆，海马基因和蛋白表达的检测提示可能与促进了神经系统的发育有关。尽管未见低剂量的DBP对生殖和发育产生明显的毒性效应，却发现其减少雄性仔鼠的前肢悬挂时间、降低空间学习记忆能力。虽然这种低剂量引起的效应在机制探讨中未得到恰当的解释，但由于这个剂量低于目前报道的基于形态学的NOAEL（50mg／kg／day），提示神经行为尤其是学习记忆更容易受到DBP暴露的影响，在今后的危险评价工作中应引起充分重视。

论文目录

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• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 0雌性大鼠生殖和F₁仔鼠生长发育的影响'>第一部分 DBP对F₀雌性大鼠生殖和F₁仔鼠生长发育的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 1大鼠神经行为发育的影响'>第二部分 DBP对F₁大鼠神经行为发育的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 DBP对雄性仔鼠海马神经细胞发育有关的基因和蛋白质表达的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 DBP对雄性大鼠成年后学习记忆以及血清生化指标和海马LTP的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 总结
• 综述 行为畸胎学实验的设计和统计分析中需要注意的问题
• 附录Ⅰ （攻读学位期间发表论文目录）
• 附录Ⅱ （附图）
• 致谢