用GFP标签定量测定蛋白质-DNA相互作用解离平衡常数的探讨

论文摘要

蛋白质与DNA之间的相互作用是基因调控的基础,通过蛋白质与DNA之间的相互作用,研究蛋白质与DNA之间的相互作用规律,对基因表达调节和揭示基因的功能都具有重要的意义。解离平衡常数是衡量蛋白质与DNA相互作用的重要热力学参数。迄今为止,研究蛋白质与DNA的相互作用的方法有很多,并且不断更新,如:DNase I足迹法,紫外交联法以及能够定量地研究蛋白质与DNA相互作用的膜过滤法（ Filter binding assay ）,凝胶阻滞电泳（ Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA ）,蛋白质与DNA复合体的电镜观察等。这些方法都有优缺点:电镜观察的方法观测结果直接,但是操作困难;以同位素为标记的方法操作简单,快速,灵敏度高,但是同位素的危害、废料处理、容易造成环境污染等缺点一直是人们所担忧的问题。因而,人们想利用一种其它的标签来代替放射性同位素标记DNA来研究蛋白质和DNA的相互作用。同时,人们一直想要通过一种快速、高通量、无污染的方法来研究蛋白质与DNA的相互作用。Xue [30] 提出了以β-1,4-D-葡聚糖酶（ β-1,4 –D -glucanase ）为标签,来研究蛋白质与DNA相互作用的方法。以蛋白质为标签,具有操作简单,快速,无污染的优势。而且,能够适应当今生物大分子的数量以几何级数增长的速度。在本研究中,探讨了一种新的测定蛋白质与DNA 相互作用解离常数的方法。以绿色荧光蛋白（ Green Fluorescent Protein,GFP）为标签测定蛋白质与DNA 的相互作用的解离常数。先将DNA 结合蛋白（ DNAbinding proteins , DBPs ）的基因与GFP 的基因顺次连

论文目录

• 提要
• 第一章 前言
• 1.1 蛋白质-DNA 相互作用
• 1.1.1 蛋白质-DNA 相互作用的研究方法
• 1.1.2 蛋白质-DNA 相互作用的定性研究方法及原理
• 1.1.3 蛋白质-DNA 相互作用的定量研究方法及原理
• 1.1.4 蛋白质-DNA 相互作用研究的展望
• 1.2 绿色荧光蛋白
• 1.2.1 GFP 的三级结构及其发光基团
• 1.2.2 GFP 荧光稳定性
• 1.3 融合蛋白标签
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验仪器
• 2.2 实验试剂及溶液的配制
• 2.3 菌株和质粒
• 2.4 PCR 引物合成及末端生物素修饰
• 2.5 计算机辅助工具
• 2.6 重组质粒的构建
• 2.7 重组质粒的筛选
• 2.8 筛选的重组质粒的测序
• 2.9 重组质粒的表达及蛋白纯化
• 2.10 GFP 为标签蛋白质DNA 相互作用的解离常数测定-
• 第三章 结果
• 3.1 重组质粒的构建
• 3.2 重组质粒的筛选
• 3.3 重组质粒的测序
• 3.4 重组质粒的表达和纯化
• 2-GFP 蛋白荧光稳定性的测定'>3.5 EREBP₂-GFP 蛋白荧光稳定性的测定
• 3.6 荧光强度与蛋白浓度的关系的测定
• 3.7 5’-biotin-dsDNA 固定效率的检测
• 3.8 GFP 为标签蛋白质-DNA 相互作用的解离常数测定
• 第四章 讨论
• 4.1 蛋白质的分离纯化
• 4.2 EREBP2-GFP 蛋白荧光强度稳定性
• 4.3 5’-biotin-dsDNA 固定效率
• 4.4 GFP 为标签蛋白质-DNA 相互作用的解离常数测定
• 4.5 GFP 为标签与 P 标记EMSA 法的比较
• 4.6 GFP 为标签与酶为标签的比较
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 摘要
• 英文摘要
• 导师及作者简介
• 附录