论文摘要
第一部分MyD88抑制剂TJ-M2010对树突状细胞生物学功能的影响[目的]探究新型MyD88抑制剂TJ-M2010对体外培养的小鼠骨髓来源树突状细胞共刺激分子表达、吞噬功能、迁移能力、凋亡、刺激T细胞增殖等生物学功能方面的影响。[方法]体外诱导培养得到BALB/c小鼠不成熟骨髓源性DC （bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs）,分为四组：空白组（不做任何处理）,CpG刺激组,CPG刺激+低浓度TJ-M2010组（20μM）,CpG刺激+高浓度TJ-M2010组（40μM）。孵育24小时后流式检测DC共刺激分子CD80、CD86及MHCⅡ和趋化因子受体CCR7的表达；westblot的方法检测NF-κB在细胞核内的表达；收集上述经不同浓度TJ-M2010处理的BALB/c BMDC,与CFSE标记的C57小鼠T细胞体外在CpG刺激下行混合淋巴细胞培养,3天后流式检测T细胞增殖情况。BALB/c BMDC中加入不同浓度TJ-M2010,利用FITC-Dextran法检测DC吞噬功能,利用Annexin-V-PI双染法检测DC凋亡及坏死情况。[结果]流式结果显示：DC经CpG刺激后高表达CD80/CD86/MHCⅡ （53.1±0.3%/55.6±3.5%/64.6±4.3%）。20μM、40μM TJ-M2010分别下降上述分子水平至（CD80:38.2%±2.2%,20.7%±1.1%; CD86:40.4%±1.6%,26.3±1.5%; MHCⅡ45.1%士2.4%，28.1士3.4%,p<0.05,vs CpG对照组）。DC经CpG刺激后CCR7表达率由25.43%上升至46.86%,20μM.40μM TJ-M2010分别使CCR7下降至36.07%和27.20%。TJ-M2010能够剂量依赖性的抑制由CpG引起的NF-κB p65的核转位。TJ-M2010能够剂量依赖性地抑制BMDC与同种反应性T细胞混合淋巴细胞培养中CD3+CFSE+T细胞比例。空白组DC吞噬FITC-Dextran阳性率为63.4%±3.4%,20μM、40μM TJ-M2010与DC共孵育后,其FITC-Dextran阳性率未见明显改变,分别为65.7%±2.6%和62.6%±2.6%（p>0.05,vs空白组）。空白组DC培养24小时后Annexin-V-PI双阳细胞比例为：6.6%士0.9%,20μM、40μM TJ-M2010与DC共孵育后,Annexin-V-PI双阳细胞比例未见明显改变,分别为：6.5%±1.1%和6.6%±1.1%（p>0.05,νs空白组）。[结论]TJ-M2010能够剂量依赖性地抑制CpG引起的DC的成熟、高迁移能力及NF-κB活化,并能够剂量依赖性地间接抑制同种反应性T淋巴细胞增殖；TJ-M2010不影响DC吞噬功能,对DC也为见明显细胞毒性作用。第二部分MyD88抑制剂TJ-M2010促进小鼠同种异基因心脏移植耐受及机制[目的]探讨MyD88抑制剂TJ-M2010在诱导小鼠同种异基因心脏移植耐受中的作用及其可能的机制。【方法】（1）建立BALB/c （H-2d）→C57BL/6（H-2b）的小鼠腹部心脏移植模型。实验分为三组：空白对照组,CMC溶媒对照组及TJ-M2010用药组。TJ-M2010用0.5%羧甲基纤维素钠（Carboxymethyl cellulose, CMC）混悬,腹腔注射给药；对照组使用相同剂量的0.5%CMC腹腔注射。手术当天记为Day0, TJ-M2010给药方案为：Day-2～Day7连续每天给药,剂量50mg/kg/天。术后每天扪诊移植心脏,观察移植物存活时间。（2）术后7天获取移植心,HE染色检测各组移植物病理改变；利用II型胶原酶消化移植物获得移植物中单个核细胞,流式检测CD11c+CD80+双阳细胞比例；实时定量荧光PCR检测移植心中IL-1、IL-6、TNF-α mRNA水平。（3）流式细胞术检测移植心长期存活小鼠脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例；分离各组脾脏细胞,INF-y ELISPOT检测各组脾脏细胞抗原反应性。（4）二次心脏移植：对移植物长期存活小鼠行供者来源二次颈部心脏移植,观察二次移植物存活时间。【结果】空白对照组（n=5）移植心存活时间MST为7.4±0.5天,CMC溶媒对照组（n=5）移植物MST为7.6±0.5天,无统计学差异（p>0.05）。而TJ-M2010组可使50%的移植心存活时间超过100天。对移植物长期存活的受者行二次心脏移植,受者可持续不排斥BALB/c心脏（>100天）。术后7天移植物病理显示TJ-M2010组淋巴细胞浸润、组织破坏等排斥反应明显轻于CMC对照组。实时定量荧光PCR示：与CMC溶媒对照组相比,TJ-M2010组移植心中IL-1、IL-6、TNF-α mRNA水平明显降低（p<0.05）。同时TJ-M2010组移植心中单个核细胞CD11c+CD80+双阳细胞比例明显低于CMC对照组。脾脏中Treg比例：CMC对照组Treg比例为6.43%,TJ-M2010组Treg比例升高至12.92%。INF-y ELISPOT显示：TJ-M2010组移植物长期存活小鼠脾脏细胞对C3H抗原反应正常（p>0.05,VS未做心脏移植的B6脾脏细胞）,而对BALB/c抗原反应性明显降低（p<0.05,VS未做心脏移植的B6脾脏细胞）。[结论]单独短期应用MyD88抑制剂TJ-M2010能够诱导供者特异性小鼠心脏移植耐受,机制上可能与减轻炎性因子分泌、诱导调节性T细胞等有关。第三部分MyD88抑制剂TJ-M2010联合anti-CD154诱导小鼠同种异基因皮肤移植耐受[目的]探讨MyD88抑制剂TJ-M2010联合anti-CD154诱导小鼠同种异基因皮肤移植耐受的可能性及其机制。[方法]建立BALB/c （H-2d）→C57BL/6（H-2b）的小鼠皮肤移植模型。实验分为三组：TJ-M2010用药组,anti-CD154组,TJ-M2010+anti-CD154组。手术当天记为Day0, TJ-M2010给药方案为：Day-2～Day7, Day9, Day11, Day13, Day15,腹腔注射,剂量50mg/kg/天。Anti-CD154（MR1clone）给药方案：Day0～Day3, Day7, Day14,腹腔注射,剂量200ug/只/次。以移植皮片完全坏死判断为排斥时间点,观察各组移植物存活时间。对移植物长期存活小鼠行供者（BALB/c）及第三方（C3H）来源二次皮肤移植或心脏移植,观察二次移植物存活时间。分离移植物长期存活小鼠脾脏中单个核细胞,流式检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例；INF-yELISPOT检测各组脾脏细胞对供者（BALB/c）及第三方（C3H）抗原反应性。[结果]TJ-M2010用药组及anti-CD154组皮肤移植物存活时间分别为（9.0±0.71）天与（9.6±0.55）天,两组之间无显著统计学差异（p>0.05）,而TJ-M2010+anti-CD154组可使22%的皮肤移植物长期存活（>100天）。对移植物长期存活的小鼠行二次心脏移植,心脏移植物全部长期存活（>100天）；二次皮肤移植,BALB/c来源皮肤移植物存活时间为（16±1.4）天,C3H来源皮肤移植物存活时间为（13.5±0.7）天：行二次皮肤移植受体同时短期给予TJ-M2010,则BALB/c皮肤移植物存活时间可延长至41天、72天（n＝2）。脾脏中Treg比例：与对照组相比,TJ-M2010+anti-CD154组Treg比例明显升高。TJ-M2010+anti-CD154组移植物长期存活小鼠脾脏对C3H抗原反应正常（p>0.05,VS未做皮肤移植的t36脾脏细胞）,而对BALB/c抗原反应性明显降低（p<0.05,VS未做皮肤移植的B6脾脏细胞）。[结论]MyD88抑制剂TJ-M2010联合anti-CD154可以诱导小鼠同种异基因皮肤移植耐受,此种耐受是一种不稳定的耐受状态,而MyD88分子在此种耐受的维持中发挥重要作用。
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