直接发酵碎米产异抗坏血酸菌株的选育及发酵条件初探

论文摘要

D-异抗坏血酸（EA）是一种新型生物型食品抗氧化剂,因其安全、高效的特性被广泛应用于食品工业中。我国是世界上最大的EA（EN）生产国,但目前市场上销售的异抗坏血酸都是间接发酵法生产的,工艺复杂,产品收率低,耗能高,这与国家提倡的低碳经济相违背,直接发酵法生产异抗坏血酸可以简化工艺,降低成本和能耗,且产品的安全性和可靠性得到保证,因此研究开发直接发酵法的生产工艺具有十分广阔的应用前景。本研究的目的是为了获得一株异抗坏血酸高产菌株,并对其发酵条件进行优化,使直接发酵法生产异抗坏血酸的工艺技术取得一定进展。本研究以灰黄青霉菌（Penicillium griseofulvum HL）为出发菌株,试验得到灰黄青霉原生质体制备的优化条件为：菌体培养48 h,用0.7 mol/L的NaCl溶液作为渗透压稳定剂,用0.5%的蜗牛酶+0.5%的纤维素酶,在pH为6,30℃条件下酶解3 h,所得原生质体数最多,达到3.14×107个/mL。原生质体再生的最佳条件为：用0.7 mol/L的蔗糖溶液配制的改进察氏培养基上其再生率最高,达到24.93%。灰黄青霉原生质体经过紫外线诱变,DES诱变,紫外线-DES诱变复合诱变,紫外线-氯化锂复合诱变选育异抗坏血酸高产菌株,通过对再生平板上长出的诱变菌株进行初筛和摇瓶复筛,最终获得一株异抗坏血酸产量较高的菌株ZD4,其产量为5.28 mg/mL,提高到出发菌株产量（1.08mg/mL）的488.9%,且连续传代6代遗传稳定。对原始菌株灰黄青霉（Penicillium griseofulvum H L）和经过原生质体诱变的菌株ZD4菌株的特性进行比较研究,结果表明,HL菌株与ZD4菌株发酵也中各种指标的变化趋势是基本一致的。相同条件下发酵培养120h,发酵液中EA的产量趋于稳定,HL菌株发酵液中EA含量到达到121 mg/mL, ZD4菌株发酵液中EA的含量达到5.18 mg/mL。采用Plackett-Burman（PB）试验设计、最陡爬坡试验设计和中心复合设计（Central Composite Design）优化ZD4菌株的发酵培养基,得到ZD4菌株发酵产异抗坏血酸的最佳培养基组分配比为碎米水解糖液13.5Brix、尿素0.5%、玉米浆1.2%、硫酸镁0.005%、磷酸氢二钾0.005%、磷酸二氢钾0.005%、Zn2+0.014%、吐温801%。在此培养基中,异抗坏血酸产量为6.92 mg/mL。通过单因素试验,得出最佳发酵条件为：种龄96h、初始pH5.5、接种量为3%、装液量为70 mL/250mL、摇床转速180 r/min、28℃,培养120 h。在优化后的培养条件及培养基中,异抗坏血酸的产量提高到7.23 mg/mL。研究了不同浓度的亚铁离子（Fe2+）对ZD4菌株产异抗坏血酸量的影响。设定不同的Fe2+浓度添加到培养基内,进行发酵培养,跟踪记录ZD4菌丝体的干重用以绘制生长曲线,观察菌落特征,测定EA含量；还在发酵的不同时期加入Fe2+,研究Fe2+抑制ZD4菌发酵产异抗坏血酸作用的可逆性,结果表明,不同浓度的Fe2+对ZD4菌株生长及产异抗坏血酸量均有抑制作用,且这种作用是不可逆的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 前言
• 1.1 D-异抗坏血酸的结构与性质
• 1.2 D-异抗坏血酸的生产研究现状
• 1.2.1 间接发酵法
• 1.2.2 直接发酵法
• 1.2.3 酶法
• 1.2.4 基因工程法
• 1.3 D-异抗坏血酸的应用
• 1.3.1 在食品工业中的应用
• 1.3.1.1 在腌制品中的应用
• 1.3.1.2 在果蔬加工中的应用
• 1.3.1.3 在肉制品水产品中的应用
• 1.3.1.4 在啤酒、饮料中的应用
• 1.3.1.5 在米面制品中的应用
• 1.3.1.6 在油脂中的应用
• 1.3.2 在其他方面的应用
• 1.4 生产D-异抗坏血酸的原料
• 1.4.1 原料的预处理
• 1.4.2 淀粉质原料在微生物发酵中的应用
• 1.5 本论文研究的意义和内容
• 1.5.1 研究目的和意义
• 1.5.2 研究内容
• 1.5.3 技术路线
• 第二章 原生质体诱变选育高产异抗坏血酸菌株
• 前言
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 溶液
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 分析方法
• 2.2.2 试验方法
• 2.2.2.1 原生质体的制备
• 2.2.2.2 原生质体的再生
• 2.2.2.3 原生质体的诱变
• 2.2.2.4 产异抗坏血酸菌株的筛选
• 2.2.2.5 遗传稳定性试验
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 原生质体制备条件的确定
• 2.3.1.1 菌体培养时间对原生质体制备的影响
• 2.3.1.2 渗透压稳定剂对原生质体制备的影响
• 2.3.1.3 酶系统的确定
• 2.3.1.4 验证实验结果
• 2.3.1.5 原生质体形成方式的观察
• 2.3.2 原生质体再生条件的确定
• 2.3.2.1 再生培养对原生质体再生的影响
• 2.3.3 原生质体的诱变
• 2.3.3.1 原生质体紫外照射剂量的确定
• 2.3.3.2 原生质体硫酸二乙酯（DES）处理时间的确定
• 2.3.3.3 紫外线-DES复合诱变
• 2.3.3.4 紫外线-氯化锂复合诱变
• 2.3.4 产异抗坏血酸菌株的筛选
• 2.3.4.1 产异抗坏血酸菌株初筛结果
• 2.3.4.2 产异抗坏血酸菌株复筛结果
• 2.3.5 遗传稳定性试验结果
• 2.4 讨论与小结
• 2.4.1 讨论
• 2.4.2 小结
• 4菌株发酵特性的比较'>第三章 HL菌株与ZD₄菌株发酵特性的比较
• 前言
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 主要仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 分析方法
• 3.2.2 试验方法
• 3.2.2.1 形态观察
• 3.2.2.2 液体发酵培养及发酵过程中相关指标的测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 菌落形态的观察
• 3.3.2 菌体生长曲线
• 3.3.3 发酵过程中还原糖含量的变化
• 3.3.4 发酵过程中pH值的变化
• 3.3.5 发酵过程中EA含量的变化
• 3.4 讨论与小结
• 3.4.1 讨论
• 3.4.2 小结
• 4菌株液态发酵异抗坏血酸工艺的优化'>第四章 ZD₄菌株液态发酵异抗坏血酸工艺的优化
• 前言
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 培养基
• 4.1.4 主要仪器设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 分析方法
• 4.2.2 试验方法
• 4.2.2.1 碎米水解糖液的制备
• 4.2.2.2 培养方法
• 4.2.2.3 产异抗坏血酸发酵培养基的优化
• 4.2.2.4 发酵条件的确定
• 4产异抗坏血酸发酵曲线与残糖含量变化的测定'>4.2.2.5 ZD₄产异抗坏血酸发酵曲线与残糖含量变化的测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 双酶法制备碎米水解糖液的结果
• 4.3.2 碳源对产异抗坏血酸的影响
• 4.3.6 Plackett-Burman设计方案及试验结果
• 4.3.7 最陡爬坡试验结果
• 4.3.8 中心组合试验（CCD）设计及响应面分析
• 4.3.8.1 中心组合试验设计及结果分析
• 4.3.8.2 模型的建立及显著性检验
• 4.3.8.3 响应面分析
• 4.3.9 发酵条件对产异抗坏血酸的影响
• 4.3.9.1 种龄对产异抗坏血酸的影响
• 4.3.9.2 培养温度对产异抗坏血酸的影响
• 4.3.9.3 接种量对产异抗坏血酸的影响
• 4.3.9.4 培养基初始pH值对产异抗坏血酸的影响
• 4.3.9.5 装液量对产异抗坏血酸的影响
• 4.3.9.6 摇瓶转速对产异抗坏血酸的影响
• 4产异抗坏血酸量与残糖含量变化'>4.3.10 ZD₄产异抗坏血酸量与残糖含量变化
• 4.4 讨论与小结
• 4.4.1 讨论
• 4.4.2 小结
• 2+对ZD₄菌株产异抗坏血酸影响'>第五章 Fe²⁺对ZD₄菌株产异抗坏血酸影响
• 前言
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌种
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 培养基
• 5.1.4 溶液
• 5.1.5 主要仪器设备
• 5.2 方法
• 5.2.1 分析方法
• 5.2.2 试验方法
• 5.2.2.1 培养方法
• 2+菌落形态的观察'>5.2.2.2 加入Fe²⁺菌落形态的观察
• 2+对ZD₄生长及EA产量的影响'>5.2.2.3 不同浓度的Fe²⁺对ZD₄生长及EA产量的影响
• 2+对ZD₄菌株发酵产异抗坏血酸作用过程'>5.2.2.4 Fe²⁺对ZD₄菌株发酵产异抗坏血酸作用过程
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 菌落观察
• 2+对ZD₄菌株生长曲线的影响'>5.3.2 不同浓度的Fe²⁺对ZD₄菌株生长曲线的影响
• 2+浓度对EA产量的影响'>5.3.3 不同Fe²⁺浓度对EA产量的影响
• 2+对ZD₄菌株发酵产异抗坏血酸作用过程'>5.3.4 Fe²⁺对ZD₄菌株发酵产异抗坏血酸作用过程
• 5.4 讨论与小结
• 5.4.1 讨论
• 5.4.2 小结
• 第六章 结论与展望
• 前言
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介