论文摘要
果胶酶是降解果胶类物质所需多种酶的总称。果胶酶的用途十分广泛，例如，用于饲料行业消除抗营养因子的添加剂，用于食品行业中果汁的提取和澄清处理，用于纺织业中麻类生物脱胶和棉纤维生物精炼以及用于造纸行业中的生物制浆。作为各行各业清洁生产的工具酶，碱性果胶裂解酶近年来受到越来越多的关注。本研究以基因组测序注释拥有14个果胶酶基因的麻类脱胶高效菌株DCE-01为基础，采用分子生物学、生物化学、酶学、结构生物学、生物信息学等方法，从基因水平和蛋白质酶学两个层面，开展果胶酶基因克隆及其表达产物的催化功能、酶学性质、分子结构等研究，获得如下结果：1.根据全基因组测序注释结果设计引物，从DCE-01菌株中成功克隆到14个果胶酶基因，包括11个果胶解聚酶基因、2个果胶酯酶基因和1个果胶脱乙酰基酶基因。其核苷酸序列与其他微生物来源的果胶酶基因核苷酸序列的一致性在71%-100%之间，其中，一致性高于95%的基因序列占1.8%，低于85%的基因序列占58.5%。DCE-01菌株所有14个果胶酶基因核酸序列之间的一致性在36.3%-84.2%之间；同样属于果胶解聚酶基因的核酸序列一致性同样在36.1%-84.2%之间，两个果胶酯酶的核酸序列一致性仅为42.8%。2.以果胶酶基因核苷酸序列为基础，生物信息学分析结果表明：DCE-01菌株14个果胶酶氨基酸序列与其他微生物的果胶酶氨基酸序列一致性在21%-100%之间，其中，氨基酸序列一致性在95%以上者占1.8%，一致性低于50%者占54.6%，与Dickeya dadantii3937的PelB（Pectate lyaseB）氨基酸序列比较，DCE-01菌株果胶解聚酶419在8个氨基酸位点上存在差异；DCE-01菌株的14个果胶酶氨基酸序列的一致性为16.4%-84.8%；MEGA聚类分析证明，该菌株果胶酶进化关系十分复杂。在14种果胶酶中，具有明显信号肽的果胶酶9种，没有明显信号肽的5种；定位在胞外的果胶酶10种，定位在胞内的2种，定位在细胞膜外膜的1种，无明确定位的1种；果胶酶分子量为30-90kDa；等电点为5.0-9.5。构建14个果胶酶基因的原核表达体系，平板水解圈法、酶活力测定法、SDS-PAGE电泳鉴定，有12个果胶酶基因获得成功表达，其中10个基因表达出具有生物活性的胞外果胶酶。经IPTG诱导，DNS法测定，有9个基因工程菌株的胞外果胶解聚酶活力为0.08-164.9IU/mL。深入研究结果表明，果胶解聚酶RP65、5P8、SH8和4J4的最适反应温度分别为50°C、45°C、50°C和55°C；最适pH均为8.5；热稳定温度分别为40°C、40°C、35°C和45°C；最适Ca2+终浓度分别为0.5mmol/L、0mmol/L、2.0mmol/L和1.0mmol/L；最适底物分别为酯化度20%-34%的橘子果胶、聚半乳糖醛酸钠、酯化度20%-34%的橘子果胶和酯化度≥85%的橘子果胶。3. Pel419的最适反应温度为50°C；保温1.0h，酶活稳定温度≤45°C；最适pH为9.0；稳定pH为8.5-10.0；Ca2+、Zn2+和NH4+促进酶活力，Ca2+的最适作用终浓度为2.0mmol/L，Fe3+、Pb2+和EDTA严重抑制酶活力；聚半乳糖醛酸钠为最适底物。PelG403最适反应温度为55°C；保温1.0h，酶活稳定温度≤60°C；最适反应pH为9.5；稳定pH为9.0-10.0；Ca2+能最大幅度提高酶活力，其最适作用终浓度为1.5mmol/L，Pb2+和EDTA能严重抑制酶活力；苹果果胶为最适底物。诱导基因工程菌株pEASY-E1-243/BL21表达有生物活性的胞外果胶酯酶，以高度酯化橘子果胶（DE≥85%）为底物，测定其发酵液酶活为1.5IU/mL，是原始菌株DCE-01的22.4倍。综上所述，本研究成功从DCE-01菌株中克隆出全基因组测序注释的14个果胶酶基因。通过系统研究果胶酶基因核苷酸序列及果胶酶分子结构、酶学性质、催化功能，证实DCE-01菌株果胶酶基因资源具有极为丰富的多样性。初步鉴定出在生物质加工过程中具有重要工业化应用前景的工具酶3种，为阐明麻类生物脱胶的作用机理提供科学依据，为发掘优异生物质加工用果胶酶资源奠定基础。