论文摘要
本文对重组大肠杆菌（pRIL+pET28-pfa）高密度发酵培养基及发酵工艺进行了系统的研究。确定出最佳培养基组成为（g/L）:葡萄糖10.0,酵母膏11.5,蛋白胨（鱼粉）19.5,（NH4）2SO4 4.0,K2HPO4·3H2O 18.0,KH2PO4 3.0,MgSO4 1.2,微量元素母液1.0 mL。对重组大肠杆菌诱导条件进行了优化,得到最佳的诱导时机为菌体对数生长中后期（A600达到7.0左右）,乳糖浓度为1 g/L,诱导时间为8 h。对摇瓶中培养条件的优化采用单因子实验法,研究了温度、培养基初始pH、装液量、种龄和接种量等对工程菌生长和产酶的影响,确定了最佳培养条件为:温度37℃、培养基装液量35 mL/250 mL、培养基初始pH7.1、种子培养时间8 h、接种量1%。采用优化后的培养基及培养条件,发酵18 h,菌体密度A600达到12.8,菌体干重为4.7 g（DCW）/L,酶活力达到210 U/mL发酵液,分别为初始条件下的3.1和14.9倍。采用分批补料的方法发酵重组大肠杆菌（pRIL+pET28-pfa）,对发酵工艺及高密度发酵的方法进行了探索。在发酵罐实验中,比较几种不同的补料策略:恒速流加法、pH-Stat流加法、指数流加法和变指数-恒pH值混合流加法。结果表明:变指数-恒pH值混合流加法更能有效地避免发酵过程中低分子有机酸的积累,菌体浓度A600最终达到165,菌体干重为62.7 g（DCW）/L,酶活力达到700 U/mL。探索了大肠杆菌主要厌氧代谢途径可能对高密度重组大肠杆菌发酵的影响。分别敲除了大肠杆菌主要厌氧代谢途径的丙酮酸-甲酸裂解酶编码基因pflA/B、pflC/D以及pflE/F,获得了pflA/B-、pflC/D-、pflE/F-突变株。发酵实验表明:突变株表达重组蛋白的能力有了一定程度的提高。突变株与原始菌相比,乙酸产量有了一定的降低,尤其pflA/B-仅为原始菌的30%;但同时也发现,乳酸的产量都有了不同程度的增加。