浙江B型和非B型ZHJ-1烟粉虱共生细菌的多样性及功能研究

论文摘要

烟粉虱Bemisia tabaci（Homoptera：Aleyrodidae）（Gennadius）是全世界热带、亚热带及相邻温带地区的一种主要作物害虫，是一个处于快速进化中的复合种，包括多个生物型和隐蔽种。B型烟粉虱入侵中国后，在一些地区已经取代中国本地烟粉虱成为优势种。烟粉虱以植物韧皮部汁液为食，体内存在可提供营养的原生共生细菌（Primary endosymbiont）和次生共生细菌（Secondary endosymbiont）。原生共生细菌与寄主长期协同进化，可以提供寄主食物中缺乏的必需氨基酸，是寄主存活所不可或缺的。次生共生细菌不是寄主存活所必需的，但对寄主的适应性、与其他昆虫竞争、对天敌的抵抗力等方面，都具有重要作用。为探讨共生细菌在B型烟粉虱入侵并替代中国本地烟粉虱的过程中所可能起到的作用，本文首先通过分子生物学方法对B型烟粉虱和本地非B型ZHJ-1烟粉虱体内共生细菌的种类进行调查，然后应用抗生素处理来了解共生细菌对烟粉虱生物学特性的影响。结果如下：（1）16S rDNA通用引物扩增出烟粉虱体内4种共生细菌，分别是原生共生细菌Portiera aleyrodidarum、次生共生细菌Hamiltonella defensa、Arsenophonus和Wolbachia。（2）通过共生细菌的特异性引物，PCR检测采自浙江的B型烟粉虱和ZHJ-1烟粉虱中共生细菌的分布情况。结果表明，两个生物型均有原生共生细菌P．aleyrodidarum和衣原体Fritschea bemisiae，而其他次生共生细菌的组成存在差异。H．defensa和Rickettsia仅在B型烟粉虱中发现，而Wolbachia和Arsenophonus仅在ZHJ-1烟粉虱中发现。对原生共生细菌的系统发育分析表明，浙江的B型烟粉虱是外来的，而ZHJ-1烟粉虱是本地的。（3）选用四环素、氨苄青霉素和利福平3种抗生素，通过饲喂法喂食初羽化的烟粉虱成虫，评价其后代在寄主植物棉花上的适应性，来了解共生细菌对烟粉虱的功能。这三种抗生素都无法除去烟粉虱的原生共生细菌P．aleyrodidarum，但可以除去B型烟粉虱中的次生共生细菌H．defensa和ZHJ-1烟粉虱中的Wolbachia和Arsenophonus。B型烟粉虱成虫取食了四环素和氨苄青霉素后，其后代的发育速率和存活率均显著提高，而取食利福平后，后代发育显著延缓但后代存活率无显著变化；ZHJ-1烟粉虱成虫取食四环素和氨苄青霉素后，其后代的发育也显著加快，但后代存活率无显著变化，而ZHJ-1烟粉虱取食利福平后，后代发育显著延缓、存活率下降。这些结果表明，去除烟粉虱体内某些次生共生细菌或降低原生共生细菌的量，可对其生长发育、存活和生殖等特性产生有利或不利的影响。

论文目录

• 致谢
• 目录
• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述-同翅目昆虫及其共生细菌系统发育关系及功能研究进展
• 1 内共生体的概念
• 2 同翅目昆虫的共生细菌
• 2.1 昆虫共生细菌的类型
• 2.2 同翅目昆虫共生细菌垂直卵传的机制
• 3 同翅目昆虫的原生共生细菌
• 3.1 同翅目昆虫的原生共生细菌概况
• 3.2 原生共生细菌的功能
• 3.3 原生共生细菌对共生的适应
• 4 同翅目昆虫的次生共生细菌
• 4.1 同翅目昆虫的次生共生细菌概况
• 4.2 次生共生细菌的功能
• 5 共生细菌功能的研究方法
• 6 烟粉虱共生细菌研究
• 6.1 烟粉虱概述
• 6.2 烟粉虱原生共生细菌Candidatus Portiera aleyrodidarum
• 6.3 烟粉虱次生共生细菌
• 6.3.1 肠杆菌科次生共生细菌Candidatus Hamiltonella defensa
• 6.3.2 Arsenophonus
• 6.3.3 Wolbachia
• 6.3.4 Candidatus Fritschea bemisiae
• 6.3.5 Candidatus Cardinium hertigii
• 6.3.6 Rickettsia
• 6.4 烟粉虱共生细菌功能研究现状
• 7 本研究的目的、内容和技术路线
• 7.1 目的
• 7.2 研究内容
• 7.3 技术路线
• 第二章 基本材料和方法
• 1 养虫设备
• 1.1 人工气候养虫室
• 1.2 光照培养箱
• 1.3 养虫笼
• 1.4 微虫笼
• 2 寄主植物
• 2.1 棉花品种
• 2.2 无虫棉花的栽培
• 3 供试昆虫
• 3.1 烟粉虱种群
• 3.2 烟粉虱种群的纯化
• 3.3 烟粉虱种群的建立和维持
• 3.3.1 种群建立
• 3.3.2 种群转接和维持
• 4 主要仪器和试剂
• 4.1 主要仪器
• 4.2 主要试剂
• 5 常用分子生物学方法
• 5.1 烟粉虱DNA的提取
• 5.2 烟粉虱生物型的鉴定
• 5.3 标准PCR反应体系
• 第三章 16S rDNA通用引物鉴定烟粉虱体内共生细菌
• 1 方法
• 1.1 通用引物及反应条件
• 1.2 PCR产物的纯化
• 1.3 PCR产物的克隆
• 1.3.1 连接
• 1.3.2 转化
• 1.3.3 培养
• 1.3.4 筛选
• 1.3.4.1 初步筛选
• 1.3.4.2 提取质粒DNA
• 1.3.4.3 双酶切鉴定
• 1.4 测序
• 2 结果
• 2.1 通用引物扩增
• 2.2 共生细菌的序列及鉴定
• 3 讨论
• 第四章 烟粉虱体内共生细菌的分子探测
• 1 方法
• 1.1 共生细菌的分子探测
• 1.1.1 Portiera aleyrodidarum的探测
• 1.1.2 Hamiltonella defensa的探测
• 1.1.3 Wolbachia的探测
• 1.1.4 Arsenophonus的探测
• 1.1.5 Fritschea bemisiae的探测
• 1.1.6 Cardinium hertigii的探测
• 1.1.7 Rickettsia的探测
• 1.2 PCR产物的纯化
• 1.3 PCR产物的克隆
• 1.4 测序
• 1.5 序列分析及系统发育分析
• 2 结果与分析
• 2.1 原生共生细菌Portiera aleyrodidarum
• 2.2 肠杆菌科次生共生细菌Hamiltonella defensa
• 2.3 Wolbachia
• 2.4 Arsenophonus
• 2.5 衣原体Fritschea bemisiae
• 2.6 Cardinium hertigii
• 2.7 Rickettsia
• 3 讨论
• 第五章 抗生素对烟粉虱生长发育的影响
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 共生细菌的分子鉴定
• 1.2.2 抗生素饲喂烟粉虱的方法
• 1.2.3 适合度指标
• 1.2.4 统计分析
• 2 结果
• 2.1 抗生素处理后共生细菌的变化
• 2.2 抗生素处理后烟粉虱适合度的变化
• 3 讨论
• 3.1 抗生素对共生细菌的影响
• 3.2 抗生素对烟粉虱的影响
• 第六章 总讨论
• 1 本研究的特色与创新之处
• 2 值得继续研究的几个问题
• 附录一 试验试剂的配制方法
• 1.DNA提取时所用试剂
• 1.1 1M Tris-HCl（pH=8.0）
• 1.2 5M NaCl
• 1.3 0.5M EDTA（pH=8.0）
• 1.4 10%（W/V）SDS（pH=7.2）
• 1.5 DNA提取缓冲液
• 1.6 ProK（蛋白酶K）
• 2.电泳所用试剂
• 2.1 5×TBE Buffer
• 2.2 10%琼脂糖凝胶
• 3.克隆所用试剂
• 3.1 Ampicillin（100mg/ml）
• 3.2 IPTG（200mg/ml）
• 3.3 X-Gal（20mg/ml）
• 3.4 LB液体培养基（Luria-Bertani培养基）
• 3.5 LB固体培养基
• 3.6 麦康凯琼脂培养基
• 3.7 1M CaCl2
• 1感受态细胞'>3.8 氯化钙法制备新鲜的大肠杆菌TG₁感受态细胞
• 4.抗生素处理所用试剂
• 4.1 磷酸缓冲液（phosphate buffer,PB）
• 4.2 1.54%铁（EDTA）的水溶液
• 4.3 Hoagland—Snyder植物营养液
• 附录二 革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌细胞壁结构的比较
• 附录三 博士研究生期间的研究成果及发表的学术论文
• 参考文献