论文摘要
β-半乳糖苷酶（β-galactosidase,EC 3.2.1.23）可以将乳糖等含β-半乳糖苷双糖和寡糖降解为单糖,为生物提供可利用的碳素营养。因为能水解牛奶中的乳糖,β-半乳糖苷酶被广泛的应用于乳品工业。又因为便利的显色反应而被普遍应用于分子生物学研究。根据氨基酸序列的相似性和系统进化分析,β-半乳糖苷酶可以分别归入糖苷水解酶1、2、35和42家族（glycoside hydrolase family,GHF）。许多细菌由一个GHF-2β-半乳糖苷酶基因和其它乳糖代谢相关基因组成乳糖操纵子来利用乳糖。典型的例子就是大肠杆菌（Escherichia coli）的乳糖操纵子。某些生存于乳糖丰富环境的细菌携带有多个家族的β-半乳糖苷酶基因。但大多数携带多个β-半乳糖苷酶基因的细菌仍然由GHF-2β-半乳糖苷酶基因组成乳糖操纵子来利用乳糖。嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）是公认安全的（GRAS）微生物,作为奶制品中的益生菌和人体肠道中的正常菌群,能维持和促进人体健康。最近其基因组被测序（GenBank accession no. CP000033）,发现基因组上有一个不同于大肠杆菌乳糖操纵子的lac基因簇。特别的是该基因簇除拥有一个GHF-2β-半乳糖苷酶编码基因lacLM外,还拥有一个GHF-42β-半乳糖苷酶基因lacZ。我们好奇的是这样一个由GHF-2β-半乳糖苷酶基因和GHF-42β-半乳糖苷酶基因构成的lac基因簇在利用乳糖上是否比典型的由一个GHF-2β-半乳糖苷酶基因构成的乳糖操纵子更有优势。嗜酸乳杆菌lac基因簇的LacLM是一个异源二聚体。早先发现的β-半乳糖苷酶都是由一个基因编码的,近年来才发现了由两个基因编码的异源二聚体β-半乳糖苷酶。Nguyen等人提纯了嗜酸乳杆菌R22菌株的该酶,并研究了酶学特性,认为该酶可用于乳品工业,可是却没能将其克隆表达。迄今为止,还没有关于嗜酸乳杆菌lac基因簇的GHF-42β-半乳糖苷酶LacZ的功能研究报道。W.M.Russell等人的研究间接说明lacZ基因可能是一个沉默基因。而另一个研究却发现lacZ基因的转录水平随乳糖诱导而上调,所以lacZ基因编码产物是否真的有功能,是否能在嗜酸乳杆菌中正常表达,这两个问题还不能下结论。如果lacZ基因的编码产物的确具有β-半乳糖苷酶活性,而且能在嗜酸乳杆菌中正常表达,那么该基因作为嗜酸乳杆菌lac基因簇的两个β-半乳糖苷酶基因之一,又在嗜酸乳杆菌利用乳糖的代谢中发挥了什么样的作用呢?为了阐明嗜酸乳杆菌lac基因簇的lacZ基因的功能,以及研究LacLM和LacZ的应用价值,本文进行了以下研究:1、克隆表达和纯化了LacZ。从嗜酸乳杆菌ATCC 4356菌株的基因组中扩增该基因,并在大肠杆菌中实现了表达。在N端或C端融合His-Tag的重组LacZ都表达为无活性的包涵体,透析复性也不能恢复其活性。糖苷水解酶42家族的β-半乳糖苷酶在C端和N端都有一个保守结构域,嗜酸乳杆菌的LacZ也不例外,His-Tag很可能影响了这两个结构域的正确折叠。不融合His-Tag的重组LacZ实现了具有β-半乳糖苷酶活性的表达。优化诱导条件后,超声上清液比活力（ONPG）达到了1.14 U/mg。经过硫酸铵分级沉淀、ABTG-Agrose亲和层析、UnoQ阴离子交换和sephadex G200凝胶排阻四步纯化,得到了电泳纯的重组LacZ,比活力为43.2 U/mg。2、克隆表达和纯化了LacLM。参照已全基因组测序的嗜酸乳杆菌NCFM菌株,以ATCC 4356菌株基因组为模板,将lacLM基因克隆到pQE31质粒上,并在大肠杆菌JM109菌株中实现了可溶性表达。测序后,发现其大亚基512位氨基酸为精氨酸,不同于已知嗜酸乳杆菌菌株LacLM的大亚基。优化诱导条件后,超声上清液中酶活（ONPG）达到了1.30 U/mg。经过硫酸铵分级沉淀、阴离子交换、亲和层析和凝胶排阻四步纯化,得到了纯化的β-半乳糖苷酶,比活力为226 U/mg。3、嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶天然表达验证。以重组LacZ和LacLM为marker,将诱导后经硫酸铵初步纯化的嗜酸乳杆菌超声破菌上清液行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）,然后用固相活性染色法染色,证明嗜酸乳杆菌的这两个β-半乳糖苷酶都能正常地被诱导表达。4、测定重组酶酶学特征。使用凝胶排阻的方法测得重组LacZ的表观分子量为71.6 kDa,比较理论分子量和SDS-PAGE测得的分子量,推定活性形式为单体。以ONPG为底物测得该酶的Km值和Vmax分别是3.84±0.09 mmol/L和52.1±0.6 U/mg。其最适pH为6-6.6,最适温度为36 - 40℃,在普通冷藏温度4℃也能保持16.5 %的活性。重组LacLM的凝胶排阻表观分子量为96.3 kDa,比较理论分子量和SDS-PAGE测得的分子量。推定活性形式为异源二聚体。对ONPG的Km值和Vmax值分别是:2.18±0.12 mmol/L和273±5 U/mg,其最适PH为7,最适温度为49℃,在60℃时也能保持约50 %的活性。通过对嗜酸乳杆菌lac基因簇的lacZ基因的克隆表达,我们证实lacZ基因是真基因,其编码产物具有β-半乳糖苷酶活性;通过嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶天然表达验证,发现LacZ存在于诱导后的嗜酸乳杆菌菌体中,这表明嗜酸乳杆菌lac基因簇的lacZ基因不仅是一个真基因而且能在嗜酸乳杆菌中正常表达。充分说明LacZ参与了嗜酸乳杆菌的乳糖利用。LacZ和LacLM的酶学性质中区别最大的是温度范围。LacZ最适温度为36-40℃,在低至4℃的温度下也能保持16.5 %的活性,在高温下活性较差,温度升至55℃时,就基本丧失了活性;而LacLM的最适温度为49℃,在低温下活性很弱,在4℃,基本不表现活性,在高温下活性良好,温度升至60℃时也能保持约50 %的活性。可以推测,当嗜酸乳杆菌在在低温环境（如:冷藏柜、泡菜坛）中生存时,由LacZ来降解乳糖;在中温环境（如:人体肠道）中生存时,两个酶共同参与降解乳糖;在高温环境（如:奶酪发酵,酸奶发酵）中则由LacLM降解乳糖。嗜酸乳杆菌lac基因簇不像大肠杆菌的乳糖操纵子只有一个GHF-2β-半乳糖苷酶,还有GHF-42β-半乳糖苷酶。其原因可能就是为了适应温度变化,使该菌利用乳糖的温度范围变得更宽,在低温下也能利用乳糖。本研究对这两个β-半乳糖苷酶的克隆表达,使其产量比原菌株提高了5倍以上,通过纯化研究,提供了工业纯化可能的路线,为其工业应用打下了基础。奶制品的生产离不开加热消毒和低温冷藏,如果在加热消毒时加入LacLM,可以在消毒的同时降解奶制品中的乳糖,如果在冷藏时加入LacZ,就可以在冷藏时降解乳糖。这两个酶来自益生菌,不存在食品安全问题。而且催化效率较好,也适合牛奶的pH值。所以这两种β-半乳糖苷酶均可能用于低乳糖奶的生产。
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