论文摘要
A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,能在人、猪和禽等物种中传播。因其高变异能力与高传染性等,给人们的身体健康带来巨大的威胁。预防控制流感病毒的传播与致病一直是科研工作者们努力的方向,清楚的了解其致病机制为疾病的预防控制提供了有力的依据。在流感病毒感染宿主细胞后,病毒蛋白会通过自身蛋白与宿主蛋白发生相互作用,而借用宿主本身的复制系统进行自身的复制增殖。流感病毒核输出蛋白（nuclear export protein,NEP）蛋白是因能在病毒vRNP出核过程中发挥重要作用而被认知,被命名为核输出蛋白。NEP在各种亚型的A型病毒中都比较保守,从最初确立NEP在介导病毒核糖核蛋白（vRNP）复合体输出细胞核的功能以来,对于NEP是否具有其它功能还未见报道。在本实验室先前的研究中,以NEP为诱饵蛋白筛选人脑cDNA文库,获得了多个阳性克隆,包括C-CHD3,GPS2等。在本研究中利用一些研究蛋白相互作用的方法验证NEP与GPS2（G protein pathway suppressor2）之间的相互作用,并初步阐述这种相互作用所具备的生物学特性。主要研究内容和结果如下:（1）相互作用的验证首先将酵母双杂交获得的阳性克隆GPS2与流感病毒NEP蛋白之间的相互作用在COS-1细胞上用哺乳动物双杂交技术进行验证,结果表明GPS2能与NEP之间表现出较强的相互作用;然后分别将GPS2与NEP克隆至原核表达载体,将可溶表达的融合蛋白GST-NEP和His-GPS2进行GST pull-down实验,证明两蛋白能在体外发生相互作用;分别将GPS2与NEP克隆至真核表达载体,然后分别检测共转染细胞中两个蛋白的相互作用。利用间接免疫荧光技术检测两蛋白之间的亚细胞定位,发现共表达细胞中两蛋白发生明显的共定位现象。综上可以充分验证GPS2与NEP两蛋白之间确实存在相互作用。（2）NEP与GPS2相互作用保守性研究根据序列分析,NEP在A型流感病毒中具有相当的保守性,但是不同的毒株之间还是存在少量氨基酸的差异,在本研究中将A/WSN/1933（H1N1）,A/Mexico/001/2009（H1N1）,A/duck/Hubei/Hangmei/01/2006 的 NEP 蛋白的编码序列分别克隆至哺乳动物双杂交质粒pBind-vector,利用哺乳动物双杂交技术检测GPS2与不同来源NEP之间相互作用的保守性。实验证明,GPS2与NEP之间的相互作用具有一定的保守性,与克隆的NEP蛋白之间都具有较强的相互作用。（3）NEP与GPS2相互作用区域的确定根据文献报道以及NEP蛋白结构特征,分别克隆了 NEP蛋白的多个截短突变蛋白 NEP（2-llaa）、NEP（12-21aa）、NEP（22-31aa）、NEP（32-41aa）、NEP（42-53aa）、NEP（2-53aa）、NEP（54-121aa）、NEP（12-121aa）、NEP（20-121aa）。利用哺乳动物双杂交技术筛选NEP与GPS2相互作用的结构域。实验证明,在NEP上两蛋白的互作结构域为32-41aa这一段肽链,并且该段氨基酸为核输出信号肽链。（4）GPS2对病毒增殖的影响通过模拟流感病毒聚合酶活力实验检测GPS2的表达对流感病毒聚合酶活力的影响,实验证明GPS2的过表达可以促进流感病毒聚合酶活力。同时通过模拟实验发现,同时转染一定量的NEP蛋白时,可以减缓其对聚合酶的促进作用。（5）GPS2抑制病毒增殖激活的AP-1依赖基因的表达在Hela细胞中,使用TNF-a刺激AP-1依赖基因的表达,当过表达GPS2时,其表达量明显降低。并且当GPS2主要定位于细胞质中,其对该启动子的活性抑制更加明显。同时,在Hela细胞和MDCK细胞中,使用流感病毒刺激后,发现只有在流感病毒能够增殖复制时,才能促进AP-1依赖基因的表达,并且转染GPS2后能明显抑制AP-1依赖基因的表达。