不对称分裂分子在鼠卵母细胞减数分裂中的表达和功能研究

论文摘要

不对称细胞分裂是指一个细胞分裂成两种不同发育潜能的细胞,是产生细胞多样性的一种基础方式。不对称分裂产生的两种类型的细胞在大小、形态和发育遗传物质上均有所不同。发育遗传物质在细胞内分布产生极性化,分裂平面将这些物质在子细胞将不均等分配,从而使得许多组织中产生两种不同发育潜能的细胞。在所有种属中,卵子成熟都是一种极其典型的不对称分裂。许多不对称分裂细胞在分裂前需要在细胞内产生不对称性,也就暗示着需要极性建立分子的存在。其中一些不对称性在卵子受精前即已经存在。在鼠卵中,卵子经过连续两次不对称减数分裂产生两个小的极体和一个大的卵母细胞。减数分裂的极性是由第一次减数分裂纺锤体和第一极体的极性位置决定和形成的,接着由第二次减数分裂纺锤体和第二极体的极性位置来延续。这样,阻滞于第二次减数分裂中期的鼠卵母细胞已经成为了一个极性化了的细胞。鼠卵的极性反应在减数分裂纺锤体和极体的位置以及卵浆成分的不对称分布上。通常认为卵浆和卵膜的结构和分子极性是由成熟过程中减数分裂纺锤体的极性位置决定的。但哺乳动物卵子减数分裂过程中调节纺锤体不对称位置的分子机制仍旧不甚清楚。而不同种属间不对称分裂的调节机制存在高度的进化保守性。人们对单细胞生物和多细胞生物的细胞母源性因子的分布和功能展开了广泛的研究,我们可通过这些研究来推断和发现鼠卵不对称分裂的机制。本实验主要研究三个进化高度保守的不对称分裂分子在鼠卵减数分裂和早期植入前胚胎的表达和功能,研究主要分为以下两块:1.Dlg1在鼠卵减数分裂中的表达和功能研究2.Epac和Rap1在鼠卵和植入前胚胎中的表达和功能研究第一部分:Dlg1在鼠卵减数分裂中的表达和功能研究一:鼠卵减数分裂过程中Dlg1的极性化分布研究背景和目的:研究表明Discs large homolog 1（Dlg1）蛋白在果蝇神经母细胞细胞极性形成中起到重要的作用。在神经母细胞极性形成过程中,Dlg1参与调节两大保守蛋白Pins和Gαi的皮质位置的形成,而这两大保守蛋白在从昆虫乃至哺乳动物的研究中,都证实了在调节细胞不对称分裂和纺锤体与皮质间关系中起到中心性作用。但是Dlg1在哺乳动物卵子中参与极性调节的作用却未见相关报道,本实验研究Dlg1在鼠卵中的表达和其与细胞骨架的关系,从而为进一步功能研究奠定基础。材料和方法:首先,我们用western-blot和RT-PCR验证Dlg1在鼠卵中的表达;其次用卵巢石蜡切片免疫组化方法揭示了Dlg1在卵巢的分布和表达;接着又研究了Dlg1在不同时期体内和体外卵子的亚细胞定位,并使用一些药物揭示了Dlg1和细胞骨架微丝微管之间的关系。结果:western-blot半定量分析和RT-PCR表明GV期和MII期卵子均表达Dlg1蛋白,且MII期Dlg1含量高于GV期。且western-blot结果验证了抗体的特异性。在小鼠卵巢中,Dlg1呈弥漫性分布,生殖细胞和卵泡细胞均有表达,且Dlg1在颗粒细胞中的表达伴随着卵泡发育而增强;卵子中,Dlg1分布于各个时期未成熟卵子卵浆内。单细胞免疫荧光揭示了Dlg1在减数分裂不同时期的细胞内分布。GV期,Dlg1分布于整个卵浆,且在核膜周围表达明显增强;生发泡破裂后,Dlg1重新组装并与纺锤体共表达。在GV期阻滞的卵子中,Dlg1不会发生重组装,这说明生发泡破裂启动了Dlg1的重分布。且Dlg1与纺锤体的共存可被微管特异性药物诺考达唑所破坏,故Dlg1的纺锤体样分布呈微管依赖性。伴随着纺锤体和Dlg1的极性向动物极皮质区迁移,Dlg1在对侧植物极皮质区域也出现了一种特异性分布类型—散点颗粒组成的皮质下方月牙状结构,该结构伴随着纺锤体的迁移变得更加明显,直到第一极体排出MII期形成时这种分布变得最清晰,而这种结构可被微丝解聚剂细胞松弛素B所破坏,这样该结构的形成呈微丝依赖性。结论:Dlg1存在于卵母细胞和周围颗粒细胞中,Dlg1可能形成参与颗粒细胞间的紧密连接。Dlg1可能亚细胞定位于内质网,鼠卵减数分裂过程诱导了Dlg1的极性分布,这种极性化分布呈多步骤性,受微丝和微管的调节。Dlg1分布与细胞骨架的密切关系,提示其可能参与或调节卵子极性形成,有待于进一步实验证明。二:母源性缺乏Dlg1阻滞了减数分裂进程研究背景和目的:RAN干扰技术在研究哺乳动物基因功能中是一种有效的工具。其中小发卡RNA更具有降低非特异基因干扰和增加干扰效率的优势。本实验用Dlg1基因特异性shRNA通过显微注射方法导入卵母细胞研究Dlg1在鼠卵减数分裂中的功能。材料和方法:2对长度为21-nt的Dlg1 siRNA购自Ambion公司（属预合成基因,任意两条中保证一条干扰效率达70%以上）。终浓度分别为50μM和100μM的siRNA通过显微注射的方法导入GV期卵母细胞卵浆。每个卵子的注射量约为10pL。对照组注射等量的阳性（GAPDH）或阴性对照。注射完毕后,卵子在含dbcAMP的G1培养液中培养30min,然后转入IVM培养基中,并在4hr、8hr和18hr分别统计GVBD率和第一极体排出率。同时进行Real-time RT-PCR和免疫荧光分析。结果:最初实验采用50μM浓度注射,结果两对siRNA均未对细胞周期进程产生影响。siRNA浓度换成100μM后,两对siRNA均可对Dlg1基因表达产生沉默,但ID160541效果较好且沉默率可达到70%,且18小时时沉默效率达到最高。4hr,8hr和18hr时,实验组GVBD率和第一极体排出率均明显低于阴性对照组,差别有统计学意义,不同组间GAPDH基因表达无差异。取实验组MI卵和MII行免疫荧光分析,结果多数卵子可观察到特异性分布消失和荧光强度较弱现象。结论:Dlg1基因沉默效率呈时间和浓度依赖性,ID160541可达到最好干扰效率且干扰效率最高时间为注射后18小时。母源性缺乏Dlg1可影响和阻滞减数分裂的启动和进程。第二部分:Epac和Rap1在鼠卵和植入前胚胎的表达和功能研究一:Epac和Rap1在鼠卵和植入前胚胎的动态表达研究背景和目的:cAMP是一种重要的第二信使,在卵子中通过激活蛋白激酶A（PKA）来调控减数分裂的启动。事实上PKA并不是cAMP的唯一靶蛋白,新的关于cAMP依赖性但PKA非依赖性通路研究表明cAMP/Epac/Rap1信号通路同样参与与许多类型细胞的功能行使,包括细胞分泌、细胞间粘附和连接、细胞凋亡、细胞增殖和分化等等。该通路在cAMP信号传导过程中,与PKA依赖性信号通路相互协调和补充共同扩大cAMP的作用范围而完成多种细胞功能的行使。然而该通路在鼠卵和胚胎中是否存在却未见相关报道。方法:用小鼠卵巢石蜡切片免疫组化和RT-PCR方法证实了Epac和Rap1在卵巢和卵子内的表达,同时用单细胞免疫荧光方法分别分析了Epac和Rap1在卵子和胚胎内的分布。结果:首先,利用小鼠卵巢石蜡切片免疫组化的方法证实了Epac和Rap1均同时表达于各级小鼠卵母细胞和周围卵泡颗粒细胞,RT-PCR方法验证了Epac和Rap1在mRNA水平的表达,单细胞免疫荧光结合共聚焦显微镜分析了Epac和Rap1在不同时期卵子和早期植入前胚胎的亚细胞分布特征。Epac伴随着鼠卵成熟过程,其分布也发生着特征性动态变化。GV期,Epac蛋白聚集成明显颗粒状散布在整个卵浆,呈圆点状,大小不一;生发泡破裂后,这种颗粒性分布变得更典型,分布颗粒更加密集且范围更广泛,大小一致;随后伴随着染色体向皮质方向移动,Epac蛋白颗粒性也同时呈现出极性分布,即只位于染色体对侧的皮质区域;第一极体排出后卵子发育至第二次减数分裂末期时,该颗粒性分布变得不明显,仅在卵浆中偶可见;卵子受精后发育至有明显原核期胚胎时,Epac分布呈弥散均匀状,特征性颗粒状分布消失。而作为Epac下游蛋白的Rap1在鼠卵和胚胎中的分布却完全不同。卵母细胞成熟过程中,从GV期到MII期,Rap1分布无明显变化,呈弥散均匀状遍布于整个卵浆中,分布上无明显特征性和极性;但对植入前胚胎（1细胞期至4细胞期）分析发现,Rap1在早期胚胎中分布发生明显变化,胞浆中出现较多的颗粒呈周边分布,与Epac在卵子中颗粒分布不同的是,Rap1颗粒较小,呈逗点状,大小均匀。而在以后的胚胎中,除了以上分布特征之外,可见散落融合在一起成簇的颗粒,分布在胞浆皮质区。结论:Epac和Rap1存在于鼠卵减数分裂成熟过程及植入前早期胚胎中,Epac和Rap1在卵子和胚胎发育不同时期呈动态性分布,且分别具有一定的特征性,各不相同。研究提示鼠卵和植入前胚胎中可能存在cAMP/Epac/Rap1通路。二:Epac和Rap1在鼠卵和植入前胚胎的功能分析研究背景和目的:之前研究我们揭示了Epac和Rap1在鼠卵和胚胎中分别有特异性的表达,Epac在卵子成熟过程中分布存在特异性,但发育至MII期后该特异性消失;而Rap1的特异性分布开始于原核期胚胎。本实验基于以上实验分别研究Epac在卵子成熟过程和Rap1在胚胎发育过程对细胞周期进程的影响。材料和方法:GV卵子和原核胚胎分别从5周龄B6D2F1未刺激卵巢和刺激周期输卵管中获得,Epac和Rap1抗体（1ml PBS中含200mg/ml IgG和0.1%NaN3和0.2%gelatin）分别显微注射于卵浆和原核期胚胎胞浆内。每个实验重复三次,每组每次注射30-40个卵子,所有实验中单个卵子或胚胎注射量约为10pl。对照组为等量的兔IgG（1ml PBS中含200mg/ml IgG和0.1%NaN3和0.2%gelatin）,注射完毕后分别置于IVM和G1培养液中观察对细胞周期进程的影响,同时结合免疫荧光方法分析。结果:Epac对卵子成熟的影响:抗体注射后3hr GVBD率实验组（71.6%,155/217）明显低于对照组（85.3%,91/107）:注射后18hr实验组第一极体排出率（12.9%,28/217）明显低于实验组（67.2%,71/107）。注射后3hr实验组GV阻滞卵子免疫荧光分析显示卵浆内粗颗粒状减弱或分布消失,验证了抗体注射的效果。Rap1对早期植入前胚胎有丝分裂进程的影响:注射后24hr（2细胞胚胎）和48hr的胚胎情况（4细胞胚胎）实验组（99.3%136/137;98.5%,135/137）和对照组（100%83/83;100%,83/83）间无明显区别;但抗体注射后确实影响了胚胎发育的最终结局—囊胚形成率实验组（42.3%,58/137）明显低于对照组（80.7%,67/83）。注射后48hr实验组4细胞胚胎Rap1免疫荧光染色见胞浆内Rap1染色呈低信号,颗粒状分布基本消失。结论:Epac可影响卵子减数分裂的细胞周期进程,而Rap对早期胚胎发育的有丝分裂细胞周期进程无明显影响,却影响了胚胎发育的最终结局。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 第一部分
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图（表）
• 参考文献
• 第二部分
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表论文情况
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• 学位论文评阅及答辩情况表