番茄抗坏血酸合成途径基因AMR1、GGP和GPP功能鉴定

论文摘要

抗坏血酸（AsA）是一种抗氧化剂,在植物的多个生理过程中发挥着重要的作用。抗坏血酸是广泛存在于新鲜水果蔬菜及许多生物中的一种重要的维生素,作为一种生物活性物质,它参与许多新陈代谢活动。作为一种抗氧化剂,抗坏血酸可以消除自由基伤害,减缓衰老进程和逆境胁迫。同时抗坏血酸也是一系列酶的辅助因子和生长调节因子。因此研究抗坏血酸的合成积累及其调控机制对于植物生长发育和品质形成都具有重要的意义。抗坏血酸的生物合成途径及其代谢调控的基因工程研究取得了突破进展。但在番茄中,仅有少数的抗坏血酸合成代谢基因被克隆和鉴定,通过克隆关键基因调控番茄中抗坏血酸合成代谢的研究还有待深入。本研究从番茄中克隆了抗坏血酸合成及调控相关基因,将其在番茄中超量表达或抑制表达,系统地对相应的转基因材料进行相应表达量及抗坏血酸含量的测定,初步鉴定了AMR1、GGP及GPPs在番茄抗坏血酸合成与代谢调控中的作用。主要结果如下：1.克隆了番茄调控因子AMR1编码基因,其ORF为1283 bp,编码406个氨基酸；克隆了番茄抗坏血酸Smirnoff合成途径中的GDP-L-半乳糖磷酸化酶GGP,ORF为1314 bp,编码437个氨基酸：克隆了L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶基因家族中的两个成员GPP1和GPP2,其ORF分别为822 bp和807 bp,分别编码273和268个氨基酸,核酸水平的一致性为81%,氨基酸水平的相似性为80%。2. AMR1、GGP, GPP1及GPP2组织表达谱分析结果表明其在番茄根、茎、叶、花和各个发育时期果实中均呈组成型表达,但不同组织间表达水平存在差异。结果表明AMR1在跟中表达量最高,GGP和GPP1在叶中表达量最高,而GPP2则在花中表达量最高。测定番茄品系AC的根、茎、叶、花和各个发育时期果实中抗坏血酸含量,结果表明总抗坏血酸含量存在较大差异,在根中含量最低,叶片中含量最高；随着果实的发育,总抗坏血酸含量呈现出逐渐增加的趋势,以红熟期果实抗坏血酸含量为最高。分析各组织基因表达与抗坏血酸积累的相关性,AMR1相关性为-0.64583,GGP相关性为0.505171,GPP1相关性为0.731284,GPP2相关性为0.690334。3.构建了AMR1和GGP超量及干涉（RNAi）表达载体、GPP1和GPP2超量表达载体和共干涉表达载体,利用农杆菌介导的遗传转化方法将它们转入番茄常规品系AC中。获得的番茄转化植株经PCR检测,结果表明外源基因已插入番茄基因组中。4.利用qPCR检测了部分转基因植株中目标基因的表达情况,结果表明超量表达株系中目标基因表达量显著提高,干涉转基因株系中目标基因表达被显著抑制。5.采用酶标仪对AMR1超量及干涉转基因株系叶片中总抗坏血酸的含量进行了测定。结果表明,在番茄中提高AMR1的表达可显著降低番茄叶片中总抗坏血酸的含量,抑制AMR1的表达后番茄叶片中总抗坏血酸的含量略微有所升高；采用HPLC对转基因株系破色期果实中抗坏血酸的含量进行了测定,结果表明超量或抑制AMR1表达对番茄破色期果实中总抗坏血酸含量没有明显影响。6.采用酶标仪对GGP超量及干涉转基因株系叶片中总抗坏血酸的含量进行了测定,采用HPLC对转基因株系果实中抗坏血酸的含量进行了测定。结果表明,GGP超量表达对番茄叶片和果实总抗坏血酸含量没有明显影响；抑制GGP表达显著降低番茄叶片和果实总抗坏血酸含量。7.采用酶标仪对GPPl和GPP2超量转基因株系叶片中总抗坏血酸的含量进行了测定,GPP1超量表达显著提高了番茄叶片中总抗坏血酸含量,GPP2超量表达也提高了番茄叶片中总抗坏血酸含量,但变化并不显著。采用HPLC对GPPs共干涉转基因株系果实中抗坏血酸的含量进行了测定,结果表明GPPs共干涉株系破色期果实总抗坏血酸含量相比非转基因材料没有太大差异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 课题的提出
• 2 抗坏血酸在植物中的生理功能
• 2.1 AsA在光合作用与光保护中起重要作用
• 2.2 AsA在植物体的抗氧化系统中起重要作用
• 2.3 AsA在细胞壁代谢和细胞膨大中的作用
• 2.4 AsA在细胞分裂中的作用
• 2.5 抗坏血酸对花期调控的作用
• 2.6 抗坏血酸调控植物叶片的衰老
• 3 植物抗坏血酸生物合成途径
• 3.1 D-甘露糖/L-半乳糖途径
• 3.2 糖醛酸转变途径
• 3.3 古洛糖途径
• 3.4 肌醇途径
• 4 ASA在植物体中的代谢
• 4.1 AsA在植物细胞内的运输
• 4.2 AsA在植物体内的氧化还原过程
• 4.3 植物体内AsA的降解
• 5 抗坏血酸与环境胁迫
• 6 番茄抗坏血酸合成代谢研究进展
• 7 本研究的目的、内容和意义
• 第二章 AMR1的功能鉴定
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 试剂、菌株和载体
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 AMR1组织表达谱及各组织抗坏血酸含量分析
• 2.3.2 目标基因获得及分析
• 2.3.3 超量表达载体的构建
• 2.3.4 干涉表达载体的构建
• 2.3.5 番茄的遗传转化
• 2.3.6 转基因植株的阳性检测
• 2.3.7 转基因植株的基因表达分析
• 2.3.8 抗坏血酸含量的测定
• 2.3.8.1 超量及干涉转基因植株叶片抗坏血酸含量的测定
• 2.3.8.2 超量及干涉转基因植株破色期果实抗坏血酸含量的测定
• 2.3.9 数据处理
• 3 结果与分析
• 3.1 AMR1组织表达分析及各组织抗坏血酸含量分析
• 3.2 AMR1的克隆及序列分析
• 3.3 转基因植株的获得及分子检测
• 3.4 转基因番茄株系叶片中相对表达量及抗坏血酸含量的分析
• 3.4.1 超量表达AMR1降低了番茄叶片抗坏血酸含量
• 3.4.2 抑制AMR1表达提高了番茄叶片抗坏血酸含量
• 3.5 转基因番茄株系果实中抗坏血酸含量的分析
• 3.6 AMR1超量表达株系中抗坏血酸合成相关基因的表达分析
• 4 讨论
• 第三章 GGP的功能鉴定
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 主要试剂、菌株及载体
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 RNA抽提及反转录
• 2.3.2 GGP基因的组织表达谱及各组织抗坏血酸含量分析
• 2.3.3 GGP扩增和测序分析
• 2.3.4 干涉及超量表达载体的构建及番茄遗传转化
• 2.3.5 转基因植株分子检测
• 2.3.5.1 转基因植株PCR阳性检测
• 2.3.5.2 转基因植株相对表达量检测
• 2.3.6 超量转基因植株相对表达量及抗坏血酸含量分析
• 2.3.6.1 叶片相对表达量及抗坏血酸含量分析
• 2.3.6.2 果实相对表达量及抗坏血酸含量分析
• 2.3.7 干涉转基因植株相对表达量及抗坏血酸含量分析
• 3 结果与分析
• 3.1 GGP的克隆及分析
• 3.2 GGP在各组织的表达模式及抗坏血酸含量分析
• 3.3 转基因植株的获得及分子检测
• 3.3.1 转基因植株的获得及PCR阳性检测
• 3.3.2 转基因植株相对表达量检测
• 3.4 GGP超量转基因植株抗坏血酸含量分析
• 3.4.1 叶片中相对表达量及抗坏血酸含量分析
• 3.4.2 破色期果实中相对表达量及抗坏血酸含量分析
• 3.5 GGP干涉转基因植株相对表达量及抗坏血酸含量分析
• 3.6 GGP转基因株系果实中抗坏血酸合成代谢相关基因的表达分析
• 4 讨论
• 第四章 GPPs的功能鉴定
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 主要试剂、菌株及载体
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 GPPs组织表达谱及各组织抗坏血酸含量测定分析
• 2.3.2 GPPs基因扩增和序列分析
• 2.3.3 GPP1与GPP2超量表达载体的构建及番茄遗传转化
• 2.3.4 GPPs干涉表达载体的构建及番茄遗传转化
• 2.3.5 转基因株系的分子检测
• 2.3.6 GPPs超量转基因植株叶片相对表达量及抗坏血酸含量测定
• 2.3.7 共干涉转基因植株破色果实相对表达量及抗坏血酸含量测定
• 3 结果与分析
• 3.1 GPPs组织表达谱及抗坏血酸含量分析
• 3.2 GPPs基因的克隆及序列分析
• 3.3 转基因株系的获得及分子检测
• 3.4 GPPs超量转基因植株相对表达量及抗坏血酸含量分析
• 3.5 GPPs共干涉植株相对表达量及抗坏血酸含量的分析
• 3.6 GPPs超量株系抗坏血酸合成代谢相关基因的表达分析
• 3.7 GPPs共干涉株系抗坏血酸合成代谢相关基因的表达分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录