PTD-NPY融合蛋白基因的克隆、表达与鉴定

论文摘要

神经肽Y（Neuropeptide Y,NPY）是一种由36个氨基酸组成的多肽,广泛分布于中枢神经系统和外周神经系统中,尤其在端脑、视前区、视顶盖以及下丘脑含量丰富。NPY与动物的摄食行为、血压、生理节律性、呼吸调节、下丘脑神经内分泌功能以及血管收缩,平滑肌舒缩等重要的生理过程的调节密切相关。本试验利用PTD-NPY融合蛋白基因进行巴斯德毕赤酵母表达,获得高纯度的融合蛋白。利用自行设计的特异性引物,引物互为模版通过重叠延伸PCR方法,构建融合蛋白基因PTD-NPY。纯化回收融合蛋白基因片段,与PMD-18Tsimple载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞内。提取质粒后,并用双酶切反应和PCR反应对重组质粒鉴定。根据酵母表达载体pPICZαA多克隆位点和融合蛋白基因的序列,设计两条特异性引物,分别在上游引物和下游引物中加入EcoRI和XbaI两个限制性内切酶位点,回收扩增的融和基因,而后与与PMD-18Tsimple载体连接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。用试剂盒从阳性转化菌中小量提取质粒后,并用XbaI和EcoRI限制性内切酶双酶切发应,将回收纯化酶切后融和基因片段,定向克隆至酵母表达载体pPICZαA中提取质粒,并且用双酶切反应和PCR反应鉴定,并将鉴定正确的重组质粒进行序列测定。测序结果分析表明,构建的融合蛋白基因符合设计要求。将测序正确重组质粒命名为pPICZαA-PTD-NPY。将测序正确重组质粒,通过电转化的方法将重组酵母表达质粒转化至酵母Gs115宿主细胞感受态菌中,利用Zeocin抗性筛选阳性克隆,并分别利用酵母表达载体通用引物（5AOX1引物和3AOX1引物）和融和基因特异引物（P1和P4）对提取酵母基因组DNA进行PCR扩增反应,以检测融和基因在酵母基因组DNA中的整合情况。结果表明大部分具有Zeocin抗性的克隆菌基因组DNA均成功整合有融合蛋白基因PTD-NPY的重组表达盒。以1%浓度的甲醇对酵母工程菌进行诱导表达。通过Tricine-SDS-PAGE和Western-blot等手段检测经超滤浓缩后的酵母上清中存在与预期大小相符能与特异性抗体发生结合反应的蛋白条带,表明融合蛋白基因PTD-NPY在酵母细胞中实现正确表达,且表达产物可被酵母细胞分泌至培养液上清中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 第二章 PTD-NPY融合蛋白基因克隆及真核表达载体的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 融合蛋白基因PCR扩增
• 2.2 重组质粒鉴定
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 PTD-NPY融合蛋白基因在毕赤酵母中的表达与鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 重组表达质粒的鉴定
• 2.2 阳性整合重组菌株的筛选
• 2.3 PTD-NPY融合蛋白基因的诱导表达
• 2.4 PTD-NPY融合蛋白的鉴定
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介