新型毕赤酵母表面展示系统的构建及表达研究

论文摘要

随着基因工程的发展,微生物表面展示系统已发展出噬菌体展示系统、细菌表面展示系统、酵母表面展示系统等,广泛应用在生物学研究及工业生产的许多领域,例如研究蛋白质-蛋白质之间的相互识别与相互作用、由多肽构象或蛋白质突变库中获取特定功能蛋白、生产抗体、生产口服疫苗、开发全细胞催化剂、开发生物传感器、开发细胞吸附剂等等,成为竞相研究的热点。但已发展的微生物表面展示系统都存在自身明显的缺陷:噬菌体展示系统展示的多肽或蛋白分子量不能太大,否则会影响噬菌体的装配与感染;革兰氏阴性菌表面展示系统表达的重组蛋白易以包涵体形式存在,展示的蛋白不仅要通过质膜层,还要在外膜上正确的整合,这可能对展示蛋白的结构和活性产生影响;革兰氏阳性菌细胞壁厚,转化效率较低,这样会影响大容量肽库的构建;两种细菌表面展示系统均缺乏翻译后修饰功能,容易使展示的真核蛋白失活;酿酒酵母中虽存在蛋白质翻译后修饰,但糖基化方式与哺乳动物不同,它对外源蛋白N-糖基化修饰形式是高甘露糖型,糖链平均为50-150甘露糖残基,并且核心寡糖末端是α-1,3-甘露糖,从而使生产的蛋白在人体中有比较强的免疫原性,过度糖基化还可能使表达的酶等功能性蛋白失活。毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。其具有易于培养、繁殖快、具有乙醇氧化酶基因诱导型强启动子,可调控外源基因的表达、可对外源蛋白进行更接近高等生物的加工折叠和翻译后修饰、便于基因工程操作和高密度发酵等的特性,成为微生物表面展示系统极有应用前景的宿主菌。目前已有的毕赤酵母表面展示系统主要是利用来自酿酒酵母Flo1蛋白的N端絮凝结构域为锚定蛋白将外源蛋白展示于菌体表面,融合蛋白非共价连接于毕赤酵母细胞壁上。展示的外源蛋白通过N端与锚定蛋白融合,C端蛋白游离,这样的系统适合脂酶等活性位点在C端的功能蛋白。但对活性位点在N端的功能蛋白表达不利,限制了更广泛的应用。为丰富毕赤酵母展示系统,展示不同需要的外源蛋白,本文做了以下3部分工作:第一部分:Pir1型毕赤酵母表面展示系统的构建及表达研究Pir（Proteins with internal repeats）系列蛋白是酿酒酵母中共价连接细胞壁的甘露糖蛋白,C端无保守的GPI锚定序列,直接与细胞壁中β-1,3-葡聚糖相连。成熟肽蛋白N端有数目不等的重复序列,可被温和碱（30 mM NaOH,12h,4℃）从细胞壁抽提。外源蛋白可通过与Pir蛋白N端融合、C端融合或插入融合展示在菌体表面。目前Pir系列蛋白在酿酒酵母表面已成功展示了多种外源蛋白。本研究克隆了来自酿酒酵母EBY100的Pir1蛋白成熟肽基因（Pir1-a）,连接入毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K中,构建了新型毕赤酵母表面展示的通用载体pPIC9K-Pir1-a。利用α-factor信号肽将蛋白引导分泌至细胞外。通过免疫荧光分析以C端与Pir1-a蛋白融合而展示于毕赤酵母表面的增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein,EGFP）,证明新的毕赤酵母表面展示系统的构建是成功的。但激光荧光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscopy,CLSM）观察到EGFP-Pir1-a融合蛋白的展示是不规则的,分析这种不规则的展示可能与Pir1蛋白自身性质相关。进一步以Pir1成熟肽N端重复序列（Pir1-b蛋白）为锚定蛋白,构建新的毕赤酵母表面展示载体pPIC9K-Pir1-b,表面展示的模式蛋白仍采用EGFP。CLSM观察到新的融合蛋白EGFP-Pir1-b是规则的展示在重组毕赤酵母表面。Western blot证明了融合蛋白EGFP-Pir1-a与EGFP-Pir1-b可被温和碱从重组毕赤酵母细胞壁抽提,并且很少分泌到培养基中。荧光分光光度计及流式细胞仪检测发现,分别以Pir1-α和Pir1-b为锚定蛋白时,相同诱导条件下,表面展示EGFP的重组毕赤酵母菌株的荧光强度是相当的。以上结果说明酿酒酵母的Pir1蛋白可作为毕赤酵母的锚定蛋白,将外源蛋白展示于毕赤酵母表面,融合蛋白没有改变Pir1蛋白自身的锚定性质:同时说明了Pir1成熟肽蛋白中,其N端重复序列对其锚定在细胞壁起主要作用,C端序列对其在表面的不规则展示起主要作用。第二部分:α凝集素型毕赤酵母表面展示系统的构建及毕赤酵母表达重组蛋白纯化新方法的探讨α凝集素是是酿酒酵母中共价连接细胞壁的GPI（Glycosyl phosphatidylinositol）型甘露糖蛋白的一种,C端有GPI锚定序列,并通过β-1,6-葡聚糖连接至β-1,3-葡聚糖,可被β-1,3-或β-1,6-葡聚糖酶作用。外源蛋白可通过C端与α凝集素C末端融合表达而锚定在细胞表面。目前以α凝集素C末端为锚定蛋白在酿酒酵母表面已成功展示了多种外源蛋白。本研究克隆了来自酿酒酵母EBY100的α凝集素的C末端基因,连接入毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K中,构建了新型毕赤酵母表面展示通用载体pPIC9K-AGα1。利用α-factor信号肽将外源蛋白引导分泌至细胞外,同时在锚定蛋白序列前增加了MluI、ApaI限制性内切酶位点及Xpress抗原序列,提供了肠激酶作用位点。通过免疫荧光分析以C端与α凝集素的C末端蛋白融合而展示于毕赤酵母表面的EGFP,证明新的毕赤酵母表面展示系统的构建是成功的。通过荧光显微镜观察及Western blot分析证明了肠激酶可将展示在重组毕赤酵母表面的EGFP与菌体分离,从而探讨了纯化毕赤酵母表达重组蛋白的新方法:外源蛋白可利用毕赤酵母的体系进行需要的折叠、翻译后修饰并分泌到胞外,通过锚定蛋白展示于菌体表面,经肠激酶作用,可从菌体表面分离下来。第三部分:两种毕赤酵母表面展示系统展示外源蛋白能力的比较在成功地以来自酿酒酵母的Pir1蛋白及α凝集素C末端为锚定蛋白构建了毕赤酵母表面展示系统的基础上,以通过C端分别与两种锚定蛋白融合的EGFP为报告蛋白,通过研究诱导温度、诱导时间、诱导培养基初始pH、甲醇诱导浓度等摇瓶培养的发酵条件,探讨不同发酵条件分别对两种重组毕赤酵母菌株表面展示融合蛋白的影响。并在两者各自最适的发酵条件下对其展示外源蛋白的能力进行比较,结果发现α凝集素C末端为锚定蛋白时,其展示通过C端与其融合的外源蛋白的能力强于Pir1成熟肽蛋白。

论文目录

摘要

ABSTRACT

缩略词表

第一章绪论

1.1 毕赤酵母介绍

1.1.1 毕赤酵母表达宿主菌

1.1.2 毕赤酵母表达载体

1.1.3 毕赤酵母表达条件

1.1.4 毕赤酵母表达系统的优势

1.2 微生物表面展示技术介绍

1.2.1 噬菌体展示系统介绍

1.2.2 细菌表面展示系统介绍

1.2.3 酵母表面展示系统介绍

1.2.4 毕赤酵母表面展示系统介绍

1.3 绿色荧光蛋白介绍

1.4 本论文的研究工作

第二章 Pir1型毕赤酵母表面展示系统的构建及表达研究

2.1 实验材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 主要试剂

2.1.3 培养基

2.1.4 主要仪器

2.1.5 主要试剂配方

2.2 实验流程

2.3 实验方法

2.3.1 酿酒酵母（S.cerevisiae EBY100）基因组的提取

2.3.2 目的基因的扩增

2.3.3 PCR Fragment Purification Kit回收纯化目的基因片段

2.3.4 pPIC9K质粒的提取

2.3.5 酶切与回收片段

2.3.6 目的基因和载体连接

2.3.7 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.3.8 连接产物的大肠杆菌转化

2.3.9 重组子筛选与鉴定

2.3.10 增强型绿色荧光蛋白基因的扩增

2.3.11 增强型绿色荧光蛋白基因与pPIC9K-Pir1-a质粒的双酶切

2.3.12 重组质粒pPIC9K-Pir1-a-EGFP的构建

2.3.13 重组质粒线性化

2.3.14 毕赤酵母电转化感受态细胞的制备

2.3.15 毕赤酵母电转化

2.3.16 毕赤酵母重组转化子的筛选

2.3.17 重组毕赤酵母菌株的表达

2.3.18 免疫荧光分析

2.3.19 酵母细胞壁融合蛋白的提取[147]

2.3.20 发酵液的浓缩处理

2.3.21 Western-blot检测融合蛋白的定位

2.3.22 荧光分光光度计分析表面展示的增强型绿色荧光蛋白荧光强度

2.3.23 流式细胞仪分析增强型绿色荧光蛋白细胞表面锚定情况

2.4 实验结果

2.4.1 以Pir1-a为锚定蛋白、增强型绿色荧光蛋白为模式蛋白的毕赤酵母展示系统的构建

2.4.2 以Pir1-b为锚定蛋白、增强型绿色荧光蛋白为模式蛋白的毕赤酵母展示系统的构建

2.4.3 Western blot分析融合蛋白EGFP-Pir1-a与EGFP-Pir1-b的细胞定位

2.4.4 荧光分光光度计分析展示在毕赤酵母表面的增强型绿色荧光蛋白的相对荧光强度

2.4.5 流式细胞仪分析毕赤酵母表面展示的增强型绿色荧光蛋白的相对荧光强度

2.5 讨论

2.5.1 毕赤酵母表面展示系统的优点

2.5.2 已建立的毕赤酵母表面展示系统的不足

2.5.3 本研究的工作及意义

2.6 本章小结

第三章 α凝集素型毕赤酵母表面展示系统的构建及毕赤酵母表达重组蛋白纯化新方法的探讨

3.1 实验材料

3.1.1 菌株和质粒

3.1.2 主要试剂

3.1.3 培养基

3.1.4 主要仪器

3.1.5 主要试剂配方

3.2 实验流程

3.3 实验方法

3.3.1 α凝集素的C末端基因的克隆

3.3.2 PCR Fragment Purification Kit回收纯化目的基因片段

3.3.3 pPIC9K-AGα1、pPEGFP重组质粒的构建、验证、线性化、电转毕赤酵母、重组毕赤酵母转化子验证、表达、免疫荧光分析

3.3.4 肠激酶酶切展示在表面的增强型绿色荧光蛋白

3.3.5 Western blot分析肠激酶作用效果

3.4 实验结果

3.4.1 重组载体构建示意图

3.4.2 重组质粒pPIC9K-AGα1的构建

3.4.3 重组质粒pPEGFP的构建

3.4.4 重组毕赤酵母表达菌株的构建与筛选

3.4.5 增强型绿色荧光蛋白与α凝集素C末端的融合蛋白在毕赤酵母中表达与免疫荧光鉴定

3.4.6 肠激酶酶切表面展示的增强型绿色荧光蛋白

3.4.7 Western blot分析肠激酶作用效果

3.5 讨论

3.5.1 发展可选择分离表面展示的外源蛋白的新型毕赤酵母表面展示系统的意义

3.5.2 本研究的工作及意义

3.6 本章小结

第四章两种毕赤酵母表面展示系统展示外源蛋白能力的比较

4.1 实验材料

4.1.1 实验菌株

4.1.2 培养基

4.1.3 主要仪器

4.2 实验方法

4.2.1 培养条件

4.2.2 荧光分光光度计分析表面展示的增强型绿色荧光蛋白荧光强度

4.3 实验结果

4.3.1 诱导温度对融合蛋白表达的影响

4.3.2 不同pH对融合蛋白表达的影响

4.3.3 甲醇诱导浓度对融合蛋白表达的影响

4.4 实验讨论

4.4.1 毕赤酵母展示外源融合蛋白影响因素的优化

4.4.2 绿色荧光蛋白作为报告基因在蛋白表达中的应用

4.5 本章小结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

学位论文评阅及答辩情况表

附:英文文章

新型毕赤酵母表面展示系统的构建及表达研究

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