非病毒载体介导转基因鸡的初步研究

论文摘要

非病毒载体相比病毒载体具有一些优势：耐受性、相关的自身缺陷或诱导中和抗体反应性及载体构建和鉴定的简便性。实验利用流体力学注射法、肌肉注射法和睾丸注射法三种方法以非病毒载体进行转基因鸡研究，在基因治疗、基因疫苗及转基因鸡生产上有一定的指导意义。1．流体力学注射法：10%体重pCAG-EGFP质粒（40～100μg）快速静脉注射6～10日龄小公鸡（10～15s内完成）。利用荧光显微镜观察、PCR及免疫组化法鉴定8h、1d、3d、5d心、肝、脾、肺、肾组织内EGFP基因的表达，结果显示8h肝、脾、肺、肾均检测到EGFP，但很快消失。并且8h心、肝、脾、肺、肾组织基因组DNA PCR检测为阴性，说明EGFP未整合到鸡基因组上。此方法对鸡肝脏基因功能获得或缺失快速研究提供了一个有力的工具。2．肌肉注射法：6～10日龄小公鸡左腿肌肉注射pCAG-EGFP质粒40～100μg/只。利用荧光显微镜观察、PCR和免疫组化法鉴定8h、1d、3d心、肝、脾、肺、肾组织内EGFP基因的表达，结果显示8h肝、肾组织内检测到EGFP的表达，随即消失。且其PCR结果为阴性，说明EGFP未整合到鸡基因组上。此方法对快速简便的基因治疗提供了一种可能。3．睾丸注射法：18周龄体重相近、健康公鸡睾丸内注射80μg pCAG-EGFP与脂质体混合物。转染48h后，利用免疫组化法检测睾丸组织内EGFP基因的表达，结果为阳性，说明EGFP基因在睾丸组织内成功地表达；但是30、60、70d精液PCR均未检测到EGFP。导致该结果可能由于精子生成时质粒丢失或被内源性DNases的降解。尽管睾丸注射法重复性差，但其仍有一定的优势。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 1、文献综述
• 1.1 研究方法
• 1.1.1 显微注射法
• 1.1.2 逆转录病毒载体法
• 1.1.3 胚胎干细胞法
• 1.1.4 原生殖细胞（PGCs）转染法
• 1.1.5 生殖器官注射法
• 1.1.5.1 雄性生殖细胞载体法
• 1.1.5.2 卵母细胞载体法
• 1.2 转基因鸡应用前景
• 1.2.1 生产药用或保健蛋白
• 1.2.2 提高禽类的生产性能及抗病育种
• 1.2.3 应用于医学领域
• 1.2.4 应用于基础科学研究
• 1.3 鸡作为生物反应器的优势
• 1.4 鸡作为生物反应器目前所不能克服的缺点
• 1.5 存在问题与展望
• 1.6 小结
• 2、引言
• 3、试验内容
• 试验一 流体力学注射法介导转基因鸡的初步研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 pCAG-EGFP 质粒的制备
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 试剂配制
• 1.1.5 实验动物与分组
• 1.2 方法
• 1.2.1 转化感受态细胞
• 1.2.2 质粒大量提取
• 1.2.3 质粒的质量和浓度的检测
• 1.2.4 鸡基因组 DNA 提取
• 1.2.5 PCR 鉴定
• 1.2.6 免疫组化
• 2 结果
• 2.1 质粒电泳检测
• 2.2 荧光显微镜检测
• 2.3 组织 PCR 检测
• 2.4 免疫组化检测
• 3 讨论
• 试验二 肌肉注射法介导转基因鸡的初步研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 pCAG-EGFP 质粒的制备
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 实验动物与分组
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 荧光显微镜检测
• 2.2 组织 PCR 检测
• 2.3 免疫组化检测
• 3 讨论
• 试验三 睾丸注射法生产转基因鸡的初步研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 pCAG-EGFP 质粒的制备
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 实验动物与分组
• 1.1.5 手术器械
• 1.2 方法
• 1.2.1 转染液的制备：
• 1.2.2 睾丸内直接注射 pCAG-EGFP
• 2 结果
• 2.1 免疫组化检测
• 2.2 精液 PCR 检测
• 3 讨论
• 4、结论
• 参考文献
• Abstract