超声联合SonoVue促进siRNA survivin对HepG2人肝癌细胞凋亡作用的研究

超声联合SonoVue促进siRNA survivin对HepG2人肝癌细胞凋亡作用的研究

论文摘要

肝癌是我国常见肿瘤之一,目前常用的治疗方法有手术切除、药物治疗和生物治疗等,但由于发现较晚,治疗效果往往很不理想。越来越多研究表明:多基因、多阶段的癌基因或抑癌基因为肝癌发生、发展的分子学基础。因此肝癌的基因治疗成为研究热点。生存素(survivin)是肿瘤细胞中特异性高表达的抑制细胞凋亡基因之一,在肝癌细胞中亦高效表达,目前已成为肿瘤发生机制和靶向治疗研究中的热点。RNA干扰技术是指将与靶基因mRNA序列同源的短的双链RNA(小干扰RNA,siRNA)导入细胞,可导致靶基因mRNA降解和基因沉默的一项基因治疗新技术。本研究应用靶向survivin的siRNA转染肝癌细胞,促进肿瘤细胞凋亡。基因治疗中的一个重要步骤就是如何将外源治疗性基因或药物有效导入靶细胞内。目前常用的基因方法有脂质体转染、病毒感染等,但都存在效率低、安全性差等缺点。超声联合微泡造影剂介导基因转染是近年来新兴的基因转染技术,具有转染率高、操作简便、安全性高等特点。本研究用第二代微泡造影剂SonoVue联合超声介导转染survivin siRNA至HepG2细胞,以促进肿瘤细胞进一步凋亡。希望能将超声造影技术与小干扰RNA技术相结合,探讨一种新的基因转染方法。第一部分超声辐照联合微泡造影剂SonoVue介导绿色荧光蛋白pEGFP-N1转染HepG2细胞的实验研究目的研究微泡造影剂与超声辐照是否能提高绿色荧光蛋白质粒在人肝癌细胞HepG2中的转染率。方法首先配置造影剂溶液。SonoVue(声诺维)为第二代声学造影剂,每瓶含六氟化硫气体59mg及冻干粉25mg。将5ml0.9%生理盐水注入SonoVue药瓶中,用力震荡,使冻干粉完全溶解,混合均匀后形成悬浊液。实验使用的超声仪为意大利百胜公司mylab25超声诊断仪,腹部探头,频率设定为3.5MHz,机械指数(MI)0.1-1.1。超声辐照的方法为将超声探头发射面向上置于6孔细胞培养板下方,加以少量超声耦合剂,探头紧贴于培养板下方,均匀移动探头。将培养的HepG2细胞分为(1)不进行任何转染处理的细胞对照组(2)质粒+超声辐照组、(3)质粒+造影剂组、(4)造影剂浓度组:造影剂浓度分别为5%(7.5μl)、10%(15μl)、20%(30μl)、40%(60μl),80%(120μl)和100%(150μl),超声辐照时间5min,MI0.6。(5)超声机械指数组:MI分别为0.2、0.4、0.6、1.0、1.1,超声辐照时间5min,SonoVue浓度为第4组实验中转染率最高的浓度。(6)辐照时间组:分为1min、3min、5min、10min、20min。SonoVue浓度为第4组实验中转染率最高的浓度,机械指数为第5组实验中转染率最高的MI数值。将含有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N1转染人肝癌细胞HepG2,24小时后以荧光显微镜观察人肝癌细胞HepG2中的绿色荧光蛋白表达情况并用流式细胞仪测算转染率。结果造影剂浓度组中,当浓度为40%时荧光质粒转染率最高(18.11±1.63)%,与其他各组相比有显著性差异(P<0.01);而细胞生存率在造影剂浓度≥80%后显著下降,与前几组相比均有显著性差异(P<0.01)。机械指数组中MI=1.0时荧光质粒转染率最高(27.03±2.16)%,与其他各组相比质粒转染率有显著性差异(P<0.01);细胞生存率除MI=1.1组外其余各组均≥95%。超声辐照时间组中5min组荧光质粒转染率最高(27.46±2.31)%,与其他各组相比有显著性差异(P<0.05);细胞生存率随着时间的延长显著下降,10min组和20min组与其他各组相比有显著性差异(P<0.01)。结论微泡造影剂SonoVue和超声辐照能够将pEGFP-N1质粒转染HepG2细胞内,其最佳的转染条件为40%造影剂浓度,机械指数1.0,辐照时间5min。第二部分小干扰RNA生存素(siRNA-survivin)诱导Hep2细胞凋亡的实验研究目的筛选能有效抑制survivin基因表达的小干扰RNA(siRNA),并转染Hep2细胞,观察其对肝癌细胞survivin mRNA水平及细胞凋亡的影响。方法首先构建survivin与EGFP融合基因表达载体。根据人survivin的基因序列及siRNA的基本设计原则,设计3段survivin siRNA靶位点,用两步PCR法扩增siRNA表达框。将质粒psurvivin-EGFP与siRNA表达框共转染293T细胞,筛选出最有效的survivin siRNA。将筛选得到的有效siRNA表达框用Taqase处理20分钟,再用T-A克隆的方法将siRNA表达框插入载体pMD18T(TaKaRa产品),得到的重组质粒即为表达载体。将得到的survivin siRNA质粒转染Hep2细胞,分析survivin基因的表达及细胞凋亡情况。同时以不同浓度Docetaxe分别处理转染siRNA表达质粒和对照空载体的HepG2细胞以及未转染的HepG2细胞,检测细胞的存活率,观察HepG2细胞内survivin表达的下调是否影响细胞对化疗药的敏感性。结果筛选出了1段能高效抑制survivin表达的siRNA。转染靶向survivin基因第69~86 nt的siRNA表达载体后,每24h对HepG2细胞进行Annexin V和PI染色分析,结果可见Annexin V阳性而PI阴性的凋亡细胞在转染后1、2、3、4天的比率分别为4.6%、7.8%、12.3%和36.4%,Annexin V和PI染色均阳性的坏死细胞在四个时间点均低于2.0%,转染空载体pUC18的HepG2细胞在四个时间点的凋亡率均低于2.0%。抑制survivin的表达能明显增强细胞对Docetaxe的敏感性。当Docetaxe浓度≥10ng╱ml时,siRNA质粒表达组与对照空载体组以及未转染的HepG2细胞组相比,结果有显著性差异(P<0.05)。结论利用RNA干扰技术能有效抑制survivin基因表达并诱导人肝癌Hep2细胞凋亡,为进一步靶向survivin分子的体内抗肿瘤治疗研究奠定了基础。第三部分超声联合SonoVue介导siRNA-survivin促进HepG2细胞凋亡的实验研究目的比较传统的脂质体转染与在脂质体加入微泡造影剂SonoVue联合超声辐照转染siRNA-survivin至HepG2细胞并促使肝癌细胞凋亡的效果,探讨超声联合微泡造影剂在基因转染中的可行性。方法将培养的HepG2细胞分为四组:分别为对照组、造影剂+超声辐照组、脂质体转染组、脂质体+微泡造影剂SonoVue+超声辐照组,其中SonoVue浓度40%,超声辐照条件为MI1.0,辐照时间5min,将siRNA-survivin质粒转染HepG2细胞,转染结束后继续培养24小时后分别以Western blot法检测各组细胞survivin表达、RT-PCR分析HepG2细胞中的survivin mRNA的表达情况以及流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡指数(AI)。结果Western blot法检测各组细胞survivin蛋白的表达情况:与对照组相比其他各组survivin蛋白表达均有不同程度下调,其中脂质体+造影剂+超声辐照组最为明显。RT-PCR法分析HepG2细胞中的survivin mRNA的表达情况显示脂质体+造影剂+超声辐照组与各组相比有显著性差异(P<0.05),而脂质体组与造影剂+超声辐照组相比也有显著性差异(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示:脂质体+造影剂+超声辐照组的凋亡指数(AI)为(23.05±0.54)%,与各组相比有显著性差异(P<0.05),脂质体组凋亡指数(AI)为(20.55±0.38)%,与造影剂+超声辐照组(11.75±0.64)%相比也有显著性差异(P<0.05)。脂质体转染组与脂质体+微泡造影剂+超声辐照组有显著性差异(P<0.05)结论微泡造影剂和超声辐照协同脂质体转染法能够提高siRNA-survivin在肝癌细胞内的转染率,并促进肝癌细胞的凋亡。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 第一部分 超声辐照联合微泡造影剂SonoVue介导绿色荧光蛋白pEGFP转染HepG2细胞的实验研究
  • 材料与方法
  • 结果
  • 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 第二部分 小干扰RNA survivin诱导Hep2细胞凋亡的实验研究
  • 材料与方法
  • 结果
  • 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 第三部分 超声联合SonoVue介导siRNA-survivin促进HepG2细胞凋亡的实验研究
  • 材料和方法
  • 结果
  • 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 综述 超声及微泡造影剂在基因转染中的应用与发展
  • 参考文献
  • 在学校期间发表文章
  • 致谢
  • 相关论文文献

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