黄芩苷粗品化学成分的研究

论文摘要

黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗变态反应、抗氧化、抗肿瘤等作用。在含黄芩中成药及制剂中，或以黄芩原药入药，或以黄芩提取物入药，其中的有效部位为黄芩总黄酮，主要有效成分为黄芩苷。黄芩的众多制剂中，具有创造性、应用广泛、疗效确实、影响巨大的是注射用双黄连（冻干），也就是俗称的“双黄连粉针剂”。注射用双黄连（冻干）是世界上第一个工业化大生产的中药粉针剂，于1990年上市销售。注射用双黄连（冻干）彻底解决了水针剂无法解决的问题，如药品的稳定性和不溶性微粒，全面提高了质量标准，其制备方法获国家专利（中国专利公丌号CN 1039725A），1992年被国家中医药管理局指定为全国中医院首批急诊必备中成药，并被收入到2005年版《中国药典》。虽然注射用双黄连（冻干）获得殊荣无数，疗效也备受肯定，但因为它属于安全性要求极高的静脉用药制剂，在应用中也发现存在一些不良反应，如过敏等，个别病例较严重。因此如何降低不良反应发生率、提高安全性，非常值得认真研究。1课题来源、目的和意义本课题为注射用双黄连（冻干）发明人罗佳波教授系列课题中的一部分，主要从物质基础角度研究注射用双黄连（冻干）不良反应产生的原因，弄清注射用双黄连（冻干）重要处方组成——黄芩苷粗品中所含的化学成分，尤其关注黄芩苷以外的化学成分，以期为进一步完善注射用双黄连（冻干）的处方和制备工艺、提高药效、降低不良反应提供依据和帮助，使年产值达10亿元的名牌药品继续创造更高的经济价值，同时也能够为广大患者祛除病痛、恢复健康做出更大的贡献。经国内外文献检索，有关黄芩的有效成分提取、分离、分析及含量测定的研究很多，但是对于注射用双黄连（冻干）中的有效成分研究较少，而对于注射用双黄连（冻干）中主要处方组成的黄芩苷粗品的成分研究尚未发现，因此本课题的研究具有创新性。2研究方法和内容2．1黄芩苷粗品的提取提取方法参照中国药典（2005版）“注射用双黄连（冻干）”项下黄芩提取方法进行，基本工艺为水提酸沉，且酸沉次数为3次，以便达到较好的纯化效果，使粗品中黄芩苷的含量更高，而杂质更少。因药典工艺较为笼统，实验中对个别环节进行了明确和优化。2．2黄芩苷粗品中黄芩苷的分析在参考大量文献基础上，经反复试验和摸索，建立了黄芩苷的高效液相色谱测定方法，确定了测定条件为：色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18（5μm，4．6mm×250mm）柱；流动相为甲醇-水-冰醋酸（48：52：0．2）；检测波长为275nm；流速为0．8ml·min-1；柱温27℃。在上述条件下对4批黄芩苷粗品进行了测定。另外，还测定了黄芩苷粗品和黄芩苷对照品的紫外吸收光谱，两者在216nm、279nm处有相同的吸收峰，且在312nm处也有相似的吸收峰，紫外吸收光谱图高度重合。2．3黄芩苷粗品中其他黄酮类成分的分析同样在参考文献基础上，经过多次的摸索，建立了黄芩苷粗品中4种黄酮类成分的高效液相色谱测定方法，确定了苷和苷元的测定条件：色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18（5μm，4．6mm×250mm）柱；流动相：苷类成分（黄芩苷和汉黄芩苷）采用甲醇-水-冰醋酸（50：50：0．2），苷元类成分（黄芩素和汉黄芩素）采用甲醇-水-冰醋酸（61：39：0．2）；检测波长275nm；流速0．8ml·min-1；柱温27℃。在上述条件下对4批黄芩苷粗品进行了测定。2．4黄芩苷的分离根据黄芩苷的理化性质，设计了分离流程，采用沉淀法和结晶法相结合，对黄芩苷粗品中的黄芩苷进行了分离，并得到了黄芩苷单体。2．5其他成分的分离根据黄芩苷粗品中所含成分的性质，研究出独特的分离流程，巧妙地利用聚酰胺柱色谱和硅胶柱色谱，对黄芩苷粗品进行了分离，得到了黄芩素单体。另外，分离出的馏分Ⅰa固体物较少，无法进一步纯化得到结晶，经薄层色谱分析所含成分为汉黄芩素。3结果3．1黄芩苷粗品的提取共提取了4批黄芩苷粗品，均为淡黄色粉末，平均收率为3．53％。另外对药典提取工艺中二次酸沉“加适量水”进行了探讨，明确为按原料药：水=1：1的比例加入；在第三次保温后的过滤环节，宜将待滤液保温（50℃即可），以防其遇冷形成胶状物。3．2黄芩苷粗品中主要成分的分析以高效液相色谱法测定的黄芩苷粗品中黄芩苷含量平均为94．19％，回归方程：Y=3495．1 X-62．156，r=0．9999（P<0．001）；精密度实验峰面积积分值的RSD=0．69％（n=6）；重复性实验RSD=0．95％（n=6）；平均加样回收率为100．54％，RSD=1．18％（n=5）。以高效液相色谱法测定的黄芩苷粗品中黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素的平均含量分别为：3．44％、0．35％、0．06％；回归方程分别为：Y=2718．6 X-25．451，r=0．9995（P<0．001）；Y=3992．3 X-4．9443，r=0．9998（P<0．001）；Y=4083．6X-3．7952，r=0．9993（P<0．001）；精密度实验峰面积积分值的RSD分别为1．55％、1．39％和1．88％（n=6）；重复性实验RSD分别为1．41％、1．59％、1．97％（n=6）；平均加样回收率分别为100．62％、102．64％、98．00％，RSD为1．67％、1．73％、2．00％（n=5）。3．3黄芩苷粗品中主要成分的分离分离得到的黄色针状结晶鉴定如下：mp．222～224℃，盐酸-镁粉反应显阳性；UVλmaxMeOHnm：244、279、312；经薄层色谱（TLC）三种展丌剂展开，均为单一斑点，且Rf值与黄芩苷对照品相同；高效液相色谱（HPLC）中与黄芩苷对照品保留时间同为11．5min。分离得到的亮黄色针状结晶鉴定如下：mp．268～270℃，盐酸-镁粉反应呈樱红色，Molish反应阴性：UVλmaxMeOHnm：237、276、330；经TLC三种展开剂展开，均为单一斑点，且Rf值与黄芩素对照品相同；高效液相色谱中与黄芩素对照品保留时间同为12．7min。分离得到的黄色粉末（馏分Ⅰa）质量较少，未能得到结晶，经TLC和HPLC分析所含成分为汉黄芩素。4结论经过初步分析，在注射用双黄连（冻干）处方组成部分黄芩苷粗品中，主要含有黄芩苷，含量平均94％，另含有黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素，平均含量分别为3．44％、0．35％、0．06％，以上4种黄酮类化合物合计约为98％，尚含约2％左右的未知成分，有待进一步分析研究；而注射用双黄连（冻干）的不良反应与上述成分是否相关也有待进一步探讨。在黄芩苷粗品的成分分析中，建立了高效、快速、准确的HPLC分析方法，不仅初步明确了黄芩苷粗品中的主要成分，还为黄芩苷粗品以及注射用双黄连（冻干）今后生产中的质量控制提供了良好的手段。在此基础上，研究、建立黄芩苷粗品的指纹图谱，从而更精确地控制其质量，提高药品的安全性，则是今后有必要开展的一项工作将传统的聚酰胺柱色谱和硅胶柱色谱结合在一起，创建了独特的分离方法，经过对黄芩苷粗品的初步分离，得到了黄芩苷和黄芩素的单体结晶，并且证实了汉黄芩素的物质存在。随着今后工作的进一步深入，相信还会分离出更多的单体，得到更多、更有价值的信息。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 第一节 化学成分
• 1 黄酮类
• 2 苯乙醇苷和苯丙素苷类
• 3 萜和挥发油类
• 4 其他
• 第二节 有效成分提取分离
• 1 经典提取技术
• 2 现代提取技术
• 3 分离纯化技术
• 第三节 成分分析
• 1 薄层色谱
• 2 紫外光谱
• 3 高效液相色谱
• 4 其他
• 参考文献
• 第二章 黄芩苷粗品化学成分分析
• 第一节 黄芩苷粗品的提取
• 1 前言
• 2 仪器与试药
• 3 实验方法
• 4 实验结果
• 5 讨论
• 第二节 黄芩苷粗品中黄芩苷的分析
• 1 前言
• 2 仪器与试药
• 3 实验方法与结果
• 4 讨论
• 第三节 黄芩苷粗品中其他黄酮类成分的分析
• 1 前言
• 2 仪器与试药
• 3 实验方法与结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三章 黄芩苷粗品化学成分的分离
• 第一节 黄芩苷的分离
• 1 前言
• 2 仪器与试药
• 3 实验方法及结果
• 4 结论与讨论
• 第二节 其他成分的分离
• 1 前言
• 2 仪器与试药
• 3 实验方法及结果
• 4 结论与讨论
• 参考文献
• 攻读学位期间成果
• 致谢