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鸭疫里氏杆菌野生型质粒的分离、序列分析和DPP Ⅳ缺失株的构建

2020-12-14阅读(414)

鸭疫里氏杆菌野生型质粒的分离、序列分析和DPP Ⅳ缺失株的构建

论文摘要

鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌（Riemerella anatipestifer, RA）引起的家鸭、鹅、火鸡和多种禽类的一种以败血性渗出为主要特征的传染病。临床剖检症状主要表现为纤维素性心包炎、肝周炎或气囊炎,部分病例出纤维素性脑膜炎、输卵管炎或关节炎。该病给世界各国养鸭业造成了巨大经济损失。目前已报道的鸭疫里氏杆菌血清型有21种,各血清型之间交叉保护率低,使得疫苗免疫防治比较难以进行。在大多数鸭场,鸭疫里氏杆菌感染一旦发生很难彻底清除,呈现持续性感染的状态。因此加强RA分子生物学、致病和免疫机制的研究,对从根本上防治该病的发生具有重要的现实意义。本研究利用碱裂解法抽提RA临床分离株野生型质粒,通过酶切分析,引物延伸的方法获得质粒的全序列,并对其进行生物信息学分析,为质粒改造奠定基础。另外利用自杀性载体首次成功构建了RA-YM菌株的DPPⅣ缺失株,为进一步研究DPPⅣ在RA致病机制中的作用奠定基础。本研究取得的结果如下：1.鸭疫里氏杆菌野生型质粒的分离、序列分析应用碱裂解方法,对鸭疫里氏杆菌临床分离株RA-JX进行质粒抽提,获得了纯度较高的质粒。采用XbaⅠ限制性酶切,胶回收酶切片段,再与同样酶切的载体pUC18连接,得到的阳性克隆送去测序,再用引物延伸的方法,测定整个质粒的序列。分析结果显示,RA-JX菌株中含有的质粒大小为8048 bp。对质粒pRA-JX进行生物信息学分析,包括质粒全序列的ORF的搜索,ORF的同源性比较,复制子的分析等。质粒pRA-JX上存在着分别编码Rep.3, Transposase11,COG2378和Cas2ⅠⅡⅢ的主要ORF。对质粒pRA-JX ORF之外的序列BlastN比对、分析,推测质粒pRA-JX的复制子,包括质粒的复制起始蛋白以及其上游的一段序列,大小为2449 bp。本试验为进一步从分子生物学水平研究鸭疫里氏杆菌提供了技术支持。2.鸭疫里氏杆菌血清1型云梦分离株DPPⅣ缺失株的构建参照鸭疫里氏杆菌血清1型云梦分离株DPPⅣ序列,从RA-YM基因组中扩增出DPPⅣ同源臂片段,在其同源臂之间插入壮观霉素抗性基因,连接到自杀性质粒pRE112上,构建重组自杀性质粒pRE-LSR。重组自杀性质粒转化大肠杆菌X7213,以大肠杆菌X7213阳性克隆为供体菌,与受体菌RA-YM进行接合转移,涂布壮观霉素（Spc）抗性平板筛选出Spc抗性的接合子,并用PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到染色体中。本试验为进一步深入研究RA的分子致病机理奠定基础以及鸭疫里氏杆菌基因工程疫苗的设计与研发提供理论依据。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略语表
  • 第一章 文献综述
  • 1 病原学研究进展
  • 1.1 分类地位
  • 1.2 生物学特性
  • 1.3 血清型
  • 2 流行病学研究进展
  • 3 诊断方法研究进展
  • 3.1 临床诊断
  • 3.2 细菌的分离与鉴定
  • 3.3 琼脂凝胶免疫扩散试验
  • 3.4 凝集试验
  • 3.5 荧光抗体法
  • 3.6 PCR检测
  • 3.7 间接血凝试验
  • 3.8 间接免疫酶组织化学法
  • 3.9 间接ELISA检测
  • 4 防治研究进展
  • 4.1 药物防治
  • 4.2 疫苗防治
  • 4.2.1 鸭疫里氏杆菌灭活菌苗的研究
  • 4.2.2 鸭疫里氏杆菌弱毒活菌苗的研究
  • 4.2.3 鸭疫里氏杆菌亚单位疫苗的研究
  • 4.2.4 鸭疫里氏杆菌和大肠杆菌二联苗的研制
  • 5 分子生物学研究进展
  • 5.1 毒力相关基因的研究
  • 5.1.1 质粒
  • 5.1.2 环化腺苷-磷酸溶血素-唾液酸蛋白酶
  • 5.1.4 明胶水解酶
  • 5.1.5 热休克蛋白Hsp20和转座酶
  • 5.1.6 二肽肽酶Ⅳ（DPPⅣ）及锌依赖肽酶（zdp）
  • 5.2 耐药相关因子的研究
  • 5.2.1 氨基糖苷类修饰酶-3'核苷转移酶Ⅰ
  • 5.2.2 螺旋酶gyrA
  • 5.2.3 生物膜的研究
  • 5.3 单克隆抗体的研究
  • 5.4 突变体构建研究
  • 6 本研究的目的、意义和主要内容
  • 6.1 本研究的目的和意义
  • 6.2 本研究的主要内容
  • 第二章 鸭疫里氏杆菌野生型质粒的分离、序列分析 #13和穿梭质粒的构建
  • 1 目的和意义
  • 2 材料
  • 2.1 菌株和质粒
  • 2.2 主要分子生物学及生化试剂
  • 2.2.1 工具酶
  • 2.2.2 试剂盒
  • 2.2.3 生化试剂
  • 2.3 主要溶液的配制
  • 2.3.1 抗生素类
  • 2.3.2 培养基
  • 2.3.3 质粒抽提相关溶液
  • 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳试剂
  • 2.3.5 其他试剂
  • 2.4 主要仪器设备
  • 3 试验方法
  • 3.1 鸭疫里氏杆菌JX分离株的复苏
  • 3.2 质粒的提取
  • 3.2.1 SDS碱裂解法小量提取
  • 3.2.2 试剂盒大量抽提质粒
  • 3.3 质粒的酶切
  • 3.4 质粒全序列的测定
  • 3.4.1 RA-JX质粒和pUC18载体的XbalⅠ单酶切
  • 3.4.2 酶切产物的回收
  • 3.4.3 回收产物的连接
  • 3.4.4 感受态细胞的制备（氯化钙法）
  • 3.4.5 连接产物的转化
  • 3.4.6 碱裂解法小量提取质粒
  • 3.4.7 阳性克隆鉴定
  • 3.4.8 引物延伸方法获得质粒的全序列
  • 3.4.9 质粒全序列的Blast比较、分析
  • 3.5 穿梭质粒的构建
  • 3.5.1 质粒RA-JX复制起点和复制酶基因的克隆
  • 3.5.2 壮观霉素抗性基因（Spc）的扩增与克隆
  • 3.5.3 构建重组质粒pUC-RaJX
  • 3.5.4 构建重组质粒pUC-RaJX-Spc
  • 3.6 RA-YM感受态细胞的制备和转化
  • 3.6.1 用于电转化的RA-YM菌感受态细胞的制备
  • 3.6.2 电转化
  • 3.7 电击转化重组质粒的筛选和鉴定
  • 4 结果与分析
  • 4.1 质粒的提取
  • 4.2 RA-JX质粒的限制性内切酶分析
  • 4.3 pRA-JX酶切片段测序
  • 4.4 pRA-JX全序列的测定
  • 4.5 RA-JX质粒全序列的分析
  • 4.5.1 RA-JX质粒的ORF分析
  • 4.5.2 各个ORF编码的氨基酸序列的同源性分析
  • 4.5.3 质粒RA-JX复制区序列的分析与预测
  • 4.6 穿梭质粒的构建
  • 4.6.1 复制起点和复制酶基因的扩增与克隆
  • 4.6.2 Spc基因的扩增与克隆
  • 4.6.3 重组质粒pUC-RaJX的构建
  • 4.6.4 重组质粒pUC-RaJX-Spc的构建
  • 4.7 电转化重组子的鉴定
  • 5 讨论
  • 第三章 鸭疫里氏杆菌DPPⅣ基因缺失突变株的构建
  • 1 目的和意义
  • 2 材料
  • 2.1 菌株和质粒
  • 2.2 主要分子生物学及生化试剂
  • 2.2.1 工具酶
  • 2.2.2 试剂盒
  • 2.2.3 生化试剂
  • 2.3 主要溶液的配制
  • 2.4 主要仪器设备
  • 3 试验方法
  • 3.1 鸭疫里氏杆菌复苏和基因组提取
  • 3.2 鸭疫里氏杆菌YM株DppⅣ基因同源臂的克隆与鉴定
  • 3.2.1 引物设计
  • 3.2.2 DPPⅣ基因同源臂的扩增
  • 3.2.3 PCR产物的回收与纯化
  • 3.2.4 PCR产物的克隆
  • 3.2.5 感受态细胞的制备（氯化钙法）
  • 3.2.6 连接产物的转化
  • 3.2.7 质粒的小量制备
  • 3.2.8 阳性克隆鉴定
  • 3.2.9 鸭疫里氏杆菌DPPⅣ基因同源臂序列分析和测定
  • 3.3 壮观霉素抗性基因（Spc）的扩增
  • 3.4 构建重组质粒pSK-LSR
  • 3.4.1 构建重组质粒pSK-Leftarm
  • 3.4.2 构建重组质粒pSK-Leftarm- Spc
  • 3.4.3 构建重组质粒pSK-Leftarm- Spc- Rightarm（pSK-LSR）
  • 3.5 构建重组自杀性质粒pRE-LSR
  • 3.6 RA-YM DPPⅣ基因缺失菌株的筛选和鉴定
  • 3.6.1 RA-YM DPPⅣ基因缺失菌株的筛选
  • 3.6.2 突变株的鉴定
  • 4 结果与分析
  • 4.1 鸭疫里氏杆菌基因组DNA的提取
  • 4.2 重组自杀性质粒pRE-LSR的构建
  • 4.2.1 DPP Ⅳ基因同源臂的克隆
  • 4.2.2 壮观霉素抗性基因（Spc）的扩增
  • 4.2.3 构建重组质粒pSK-LSR
  • 4.2.4 构建重组自杀性质粒pRE-LSR
  • 4.2.5 RA-YM DPPⅣ基因缺失菌株的筛选和鉴定
  • 5 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢

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