论文摘要
文蛤(Meretrix meretrix)是我国沿海重要的经济贝类,是我国沿海开发滩涂、发展贝类养殖的理想对象,具有广阔的市场前景和较高的经济价值。与其他养殖贝类一样,文蛤养殖产业也正在面临着病害带来的负面影响,造成了较为严重的经济损失。开展贝类抗性品种的培育,是应对养殖病害、实现健康养殖的重要途径。从病原致病机理和宿主免疫防御机制等方面开展系统研究,能够为贝类抗性选育提供理论基础和科学方法。本研究通过对从2007年江苏沿海文蛤病害中所取文蛤样品的细菌分离、鉴定以及致病力分析发现,菌株MM21(副溶血弧菌)及MM5(类弗尼斯弧菌)能够引起文蛤较高的致死率,通过观察感染文蛤各组织的组织病理学变化以及细胞病理学变化发现,菌株MM21和MM5能够引起文蛤肝胰腺、鳃、外套膜等组织的病理学损伤,如脂滴增多、代谢紊乱、分泌加剧、颗粒沉积以及感染弧菌的入侵等。致病性以及致病机理的研究证明,弧菌属细菌是文蛤的重要致病菌,尤其是副溶血弧菌能够引起文蛤的高致死率。从宿主免疫角度出发,分别分析了弧菌感染后文蛤中免疫直接效应因子i型溶菌酶以及免疫间接效应因子热休克蛋白70的免疫应答变化。结果显示,弧菌刺激后文蛤肝胰腺和鳃中i型溶菌酶的mRNA表达量以及蛋白表达量都显著上升,另外文蛤i型溶菌酶重组蛋白对弧菌具有抗菌活性,进一步证明i型溶菌酶在文蛤抗弧菌免疫中发挥作用;同样地,弧菌刺激后文蛤肝胰腺和鳃中热休克蛋白70的mRNA表达量以及蛋白表达量也显著上升,说明热休克蛋白参与文蛤抗弧菌免疫。因此,i型溶菌酶以及热休克蛋白70能够作为反映文蛤健康状况的参数并作为候选分子标记应用于弧菌抗性文蛤品系的选育。选择抗弧菌作为育种目标,采用攻毒实验结合群体内选育的方法进行了抗性文蛤品系的选择育种,获得了抗性文蛤的亲本群体并繁育了抗性文蛤的F1子代。以致死率为表型指标的评估显示,抗性文蛤F1子代的弧菌致死率显著低于对照群体,说明抗性文蛤F1子代获得了对弧菌增加的抗性。利用已获得的弧菌抗性文蛤遗传材料对i型溶菌酶基因中存在的单核苷酸多态性(SNP)进行了研究,对不同SNP与抗性的相关性分析发现,在所检测的i型溶菌酶SNP中,10个SNP位点与文蛤抗性呈显著相关,不同基因型的文蛤平均体重存在显著差异,抗性群体相较对照群体具有独特的优势单倍型。另外这10个SNP位点与文蛤体重具有相关性。以上分析说明,i型溶菌酶中的SNP标记与文蛤抗弧菌性状相关,能够作为文蛤抗弧菌的潜在分子标记应用于弧菌抗性文蛤的选育。
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摘要Abstract第一章 文献综述1.1 引言1.2 养殖贝类主要疾病——弧菌病1.2.1 贝类弧菌病的文献报道1.2.2 弧菌的种类与鉴定手段1.2.2.1 弧菌的生化鉴定1.2.2.2 弧菌的分子鉴定1.2.3 弧菌的流行病学与致病机理1.3. 贝类的免疫应答1.3.1 直接效应免疫相关基因——溶菌酶1.3.1.1 溶菌酶的种类与功能1.3.1.2 i 型溶菌酶1.3.2 间接效应免疫相关基因——热休克蛋白1.3.2.1 热休克蛋白的种类与功能1.3.2.2 热休克蛋白701.4 贝类的抗性选育1.4.1 贝类抗性选育的原理1.4.1.1 数量遗传学的兴起1.4.1.2 贝类抗性选育的可行性1.4.1.3 贝类抗病指标的选择1.4.2 贝类抗性选育的方法1.4.2.1 表型选择与基因型选择1.4.2.2 品系选育与家系选育1.5 研究的目的和意义第二章 文蛤致病菌的分离、鉴定与致病机理分析2.1 引言2.2 文蛤致病菌副溶血弧菌的分离、鉴定、致病力与致病机理分析2.2.1 材料与方法2.2.1.1 患病文蛤体内细菌的分离与形态学分析2.2.1.2 细菌的分子鉴定2.2.1.3 细菌的生化鉴定与抗生素敏感检测2.2.1.4 细菌致病力的初步筛查分析2.2.1.5 毒力最强菌株的定量毒力检验2.2.1.6 感染文蛤的细胞病理学观察2.2.1.7 毒力基因toxR，tlh，tdh 的检测2.2.1.8 统计分析2.2.2 结果2.2.2.1 细菌的分离及其毒力初步筛查分析2.2.2.2 菌株MM21 的鉴定2.2.2.3 菌株MM21 的定量毒力分析2.2.2.4 感染MM21 后文蛤的细胞病理学变化2.2.3 讨论2.3 文蛤致病菌类弗尼斯弧菌的分离、鉴定、致病力与致病机理分析2.3.1 材料与方法2.3.1.1 患病文蛤体内细菌的分离与致病力分析2.3.1.2 细菌的分子鉴定2.3.1.3 细菌的生化鉴定2.3.1.4 细菌的毒力检测2.3.1.5 感染文蛤的细胞病理学观察2.3.1.6 感染文蛤的组织病理学观察2.3.1.7 统计分析2.3.2 结果2.3.2.1 菌株MM5 的形态特征2.3.2.2 MM5 的分子鉴定结果2.3.2.3 MM5 的生化鉴定结果2.3.2.4 MM5 的毒力测试2.3.2.5 感染MM5 文蛤的细胞病理学变化2.3.2.6 MM5 引起的组织病理学变化2.3.3 讨论第三章 文蛤免疫相关基因的克隆及其在宿主免疫应答中的功能分析3.1 引言3.2 文蛤溶菌酶基因的克隆与功能分析3.2.1 材料与方法3.2.1.1 感染实验与样品采集3.2.1.2 文蛤溶菌酶cDNA 全长的克隆3.2.1.3 序列特性分析3.2.1.4 文蛤溶菌酶的原核重组表达3.2.1.5 重组蛋白的质谱鉴定3.2.1.6 重组蛋白的溶菌酶活性分析3.2.1.7 重组蛋白的抗菌活性分析3.2.1.8 文蛤溶菌酶转录本的半定量检测3.2.1.9 文蛤溶菌酶多克隆抗体的制备3.2.1.10 文蛤溶菌酶蛋白的半定量检测3.2.1.11 统计分析3.2.2 结果3.2.2.1 文蛤溶菌酶的序列分析3.2.2.2 文蛤溶菌酶重组蛋白的获得和鉴定3.2.2.3 文蛤溶菌酶重组蛋白的活性分析3.2.2.4 文蛤溶菌酶的组织分布3.2.2.5 弧菌感染引起的文蛤溶菌酶的表达变化3.2.3 讨论3.3 文蛤热休克蛋白70 的克隆与功能分析3.3.1 材料与方法3.3.1.1 感染实验与样品采集3.3.1.2 文蛤热休克蛋白70 cDNA 全长的克隆3.3.1.3 序列特性分析3.3.1.4 文蛤热休克蛋白70 转录本的定量检测3.3.1.5 文蛤热休克蛋白70 蛋白的定量检测3.3.1.6 统计分析3.3.2 结果3.3.2.1 文蛤热休克蛋白70 的序列分析3.3.2.2 弧菌感染引起的文蛤热休克蛋白70 mRNA 的空间表达变化3.3.2.3 弧菌感染引起的文蛤热休克蛋白70 mRNA 的时间表达变化3.3.2.4 弧菌感染引起的文蛤热休克蛋白70 蛋白的空间表达变化3.3.3 讨论第四章 弧菌抗性文蛤群体的选育及溶菌酶SNP 在选育群体中的分析4.1 引言4.2 弧菌抗性文蛤群体的培育4.2.1 材料与方法4.2.1.1 文蛤亲本的弧菌感染实验4.2.1.2 文蛤的催产与受精4.2.1.3 文蛤幼虫与稚贝的培育4.2.1.4 文蛤F1 子代的弧菌感染实验4.2.1.5 统计分析4.2.2 结果4.2.2.1 弧菌抗性文蛤亲本（09-P）及其F1 子代（09RP）的获得4.2.2.2 09RP 的弧菌抗性确认4.2.3 讨论4.3 文蛤溶菌酶SNP 与弧菌抗性及生长的相关性分析4.3.1 材料与方法4.3.1.1 检测所用文蛤群体4.3.1.2 DNA 提取与体重测量4.3.1.3 溶菌酶gDNA 片段的PCR 扩增与测序4.3.1.4 SNP 检测与分型4.3.1.5 数据分析4.3.2 结果4.3.2.1 检测到的溶菌酶SNP4.3.2.2 溶菌酶SNP 与弧菌抗性的相关性分析4.3.2.3 溶菌酶SNP 与生长的相关性分析4.3.3 讨论结论参考文献博士期间发表的文章及申请的专利致谢
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