论文摘要
Polycomb家族蛋白（Polycomb group proteins,PcGs）在进化中高度保守,存在于几乎所有细胞中,在胚胎发育、胚胎干细胞和成体干细胞状态的维持、细胞命运决定以及肿瘤形成等过程中起非常重要的作用。NSPcl（Nervous System Polycomb 1,又名PCGF1,Polycomb group ring finger 1）是于2001年分离、鉴定的PcG家族的一个新基因,与哺乳动物PcG家族成员MEL18,BMI1具有较高同源性。然而,无论在功能还是在作用机制方面,NSPc1都相对缺乏研究。曾有报告指出,NSPc1在多种肿瘤中高表达;我们前期的工作结果表明,过表达NSPc1能促进肿瘤细胞增殖;相反,NSPc1敲低的肿瘤细胞则表现为生长缓慢、接触抑制。本论文重点对NSPc1抑制靶基因转录、调控细胞增殖的分子机制进行了研究。首先,我们尝试纯化NSPc1功能性复合体,同时已经有文献报道,通过串联亲和纯化（Tandem Affinity Purification,TAP）的方法,研究者发现NSPc1和其它PcG家族成员RING1,RING2,RYBP处于同一复合体中。通过免疫共沉淀（Coimmunoprecipitation,CoIP）实验,我们验证了NSPc1和RING2的相互作用。这一复合体与此前报道的组蛋白H2A泛素化复合体（human Polycomb repressive complex 1-like,hPRC1L）很相似:其中RING2具有泛素E3连接酶活性,BMI1等增强其活性,从而促进H2A泛素化。同样地,在HeLa细胞敲低NSPc1之后,细胞内泛素化H2A（uH2A）整体水平明显下降;相反,过表达NSPc1能促进H2A泛素化;并且体外重组NSPc1蛋白能显著增强RING2的活性。因此,NSPc1有可能通过促进组蛋白H2A泛素化而抑制靶基因的转录。PcG家族蛋白通常通过调控HOX基因的转录而影响体节发育,因此,我们在HeLa和NT2/D1（人胚胎肿瘤细胞）细胞中通过RT-PCR的方法筛选了NSPc1可能抑制的HOX基因。结果表明,在NSPc1敲低的细胞中,HOXA7和HOXB13表达上调较为明显。为了验证NSPc1介导的H2A泛素化是否参与这两个HOX基因的转录抑制,我们在它们的上游进行了染色质免疫沉淀实验（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP）。实验结果显示,NSPc1复合体确实结合于它们的启动子区,并且当NSPc1敲低之后,RING2在相应区域的结合减少,组蛋白H2A泛素化水平显著下降,基本验证了我们的设想。PcGs蛋白在细胞内多以复合体的形式起作用,至少可以分为两大类:起始复合体（Polycomb Repressive Complex 2,PRC2）和维持复合体（Polycomb RepressiveComplex 1,PRC1）,其中PRC2成员EZH2能引起组蛋白H3K27三甲基化（H3K27trimethylation,me3H3K27）,这一修饰又能募集PRC1复合体进一步维持靶基因的转录抑制。近年来研究还发现,PcGs的转录抑制效应与DNA甲基化（DNA methylation）紧密相关,而后者也是参与基因转录抑制的一种重要的表观遗传学修饰形式,在哺乳动物细胞内由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases,DNMTs）DNMT1负责维持DNA甲基化。通过RT-PCR实验,我们发现PRC2成员EZH2或DNA甲基转移酶DNMT1敲低、或5-aza-dC（一种DNMTs抑制剂）处理的HeLa细胞中,HOXA7的表达也去抑制,即EZH2和DNA甲基化也参与了HOXA7基因的沉默。接下来,我们致力于揭示PcGs介导的组蛋白修饰与DNA甲基化如何协调而参与HOX基因沉默。通过ChIP和基因组亚硫酸氢盐修饰后测序（Bisulfite sequencing）实验,我们发现:在HeLa细胞中当PRC2成员EZH2敲低之后,将导致DNA甲基转移酶DNMT1和PRC1成员NSPc1在HOXA7和HOXB13基因启动子区的结合都明显减少;而敲低NSPc1之后,EZH2的募集和me3H3K27水平不受影响,但是DNMT1结合却被显著抑制,并且相应的DNA甲基化的水平也明显下降;敲低DNMT1或者用其抑制剂5-aza-dC处理细胞,EZH2结合没有变化,但NSPc1结合减少。因此,在HOX基因沉默过程中,EZH2介导的me3H3K27募集NSPc1/RING2复合体,后者促进相应区域的H2A泛素化;同时,EZH2可以直接募集DNA甲基转移酶DNMTs,起始并维持相应CpG岛的DNA甲基化;而下游的H2A泛素化及DNA甲基化这两种表观遗传学修饰之间不是孤立的,而是相互依赖（interdependent）的,因为无论干扰NSPc1还是DNMT1都会影响到对方在靶基因调控区的结合和功能,使靶基因去抑制,即它们协同作用,维持HOX靶基因的稳定、长期、不可逆的沉默。本论文揭示了PcG家族蛋白NSPc1的一种转录调控模式,这一模式与近年来提出的肿瘤发生的表观遗传学机制相似,建立了NSPc1与其它表观遗传调节因子（如其它PcG蛋白和DNMTs）在细胞增殖、肿瘤发生过程中的联系。并且,其中对调节HOX靶基因转录的研究,为进一步阐明NSPc1在胚胎发育过程中的作用奠定了基础。