野油菜黄单胞菌野油菜致病变种新的依赖于Ⅲ型分泌系统的效应物的鉴定

论文摘要

黄单胞菌属由大量不同的种和变种组成，它可以侵染包括禾本科、豆科、十字花科作物在内的392种植物，在全世界每年都给农业生产造成重大经济损失。野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv．campestris，Xcc）是一种革兰氏阴性细菌，能侵染十字花科植物，引起黑腐病，是植物病原细菌与植物相互作用机理研究的模式菌之一。研究证明，Ⅲ型分泌系统（TypeⅢSecretion System，T3SS）是大部分植物和动物革兰氏阴性病原细菌致病过程中的关键装置，T3SS功能丧失后，病原菌不再具有致病性。病原菌利用T3SS将被称为效应物的蛋白分子直接注射到植物细胞的细胞质中，这些效应物包括无毒蛋白、致病因子和其它外泌蛋白（如Hrp outer protein，Hop）。全基因组测序为这些效应物的综合鉴定提供了可能，如可以根据启动子活性、与启动子相关的序列模型（PIP-box、hrpⅡbox）或效应物的靶结构域（Leucine-rich repeats，LRRs）来筛选候选效应物等。本研究以全基因组已测序的Xcc8004菌株为研究对象，根据启动子区序列或蛋白结构特征以及调控蛋白HrpG、HrpX芯片杂交结果，将Xcc的所有8个avr基因和2个LRR基因作为候选的效应物基因，利用启动子报道基因、RT-PCR、Western杂交和体内转运检测等方法鉴定这些基因是否为依赖于T3SS的效应物基因。一、Xcc 8004基因组所有的4332个基因的启动子区（起始密码子前25～500bp）搜索结果表明，有66个基因含有PIP-box（TTCGCN15，N16TTCGC），包括正义链上ORF 50个，反义链上ORF 16个；有123个基因含有hrpⅡbox（TTCG…n15，n16…TTCG），包括正义链上ORF 63个，反义链上ORF 60个。候选的效应物基因中，avrBs2和XC4273含有严谨的PIP-box，avrXccB、avrXccC、avrXccE1含有hrpⅡ box。avrBs2在已测序的其它黄单胞菌（X.campestris pv. vesicatoria, X. axonopodis pv.citri, X. oryzae pv. oryzae）中非常保守，但其它无毒基因一致性和相似性都较低，甚至没有同源基因；XC1553、XC4273、HpaF和PopC之间存在一定的同源性。二、鉴定了候选基因的Tn5gusA5插入突变体，并构建了这些候选基因的单交换整合突变体。在寄主植物萝卜和甘蓝上对这些突变体的致病性检测表明：无毒基因avrBs2是Xcc的致病相关基因；XC4273基因突变后，Xcc的致病性显著下降。三、野生型Xcc 8004在光头芥菜上不能致病。但当avrXccC基因突变后，Xcc在光头芥菜上变的可以致病。avrXccC是寄主特异性基因，它与寄主植物光头芥菜对Xcc的抗性有关。四、Xcc在抗病的拟南芥（Arabidopsis thaliana）生态型Col-0上不能致病，而XC1553的突变体具有致病特性，这种类似于无毒基因的特征可以被XC1553基因反式互补。因此，推断XC1553是一个无毒基因。五、构建了8个无毒基因的avr-hrpG双突变体和2个LRR基因的启动子报道基因。实验结果证明avrBs1.1、avrBs1、avrXccB、avrXccC、avrXccE1、XC1553和XC4273的表达是受hrpG调控的，除avrBs1和XC4273外，这些基因还受hrpX调控。六、利用本实验室构建的可以导致hrp基因组成型表达的Xcc 8004*，尝试了通过Western杂交将其用于效应物分泌检测的可能性。七、以AvrBs1的功能区为报道蛋白，分别证明XC1553和与野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria,Xcv）XopN同源的XC0241是Xcc依赖于T3SS的效应物；利用Xcv已知的效应物AvrBs3的功能区为报道蛋白，证明了AvrXccC也是依赖于T3SS的效应物。总之，本研究对Xcc 8004注释的所有编码Avr和LRR蛋白的基因，在致病性、表达调控和效应物分泌或转运等方面进行了系统研究，鉴定了两个寄主特异性基因，证明了三个基因的编码产物为Xcc新的依赖于Ⅲ型分泌系统的效应物。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写表
• 第一章 绪论
• 1.1 基因组研究
• 1.1.1 人类基因组计划
• 1.1.2 微生物基因组计划
• 1.1.3 基因组的测序
• 1.1.4 基因组的注释
• 1.1.5 微生物比较基因组
• 1.2 植物与病原菌相互作用的机理研究
• 1.2.1 病原菌致病相关的生化因子
• 1.2.2 病原菌的分泌系统
• 1.2.3 植物病原菌hrp基因簇及其调控
• 1.2.4 依赖于T3SS的效应物研究
• 1.2.5 富含亮氨酸重复与寄主-病原菌相互作用
• 1.3 寄主的抗性基因（R）
• 1.4 微阵列分析研究病原菌与寄主相互作用
• 1.5 黄单胞菌属特征及其分类现状
• 1.6 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种
• 1.6.1 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种及其致病性
• 1.6.2 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的小种分化
• 1.6.3 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的基因组
• 1.7 本研究的目的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 菌株和质粒
• 2.2 培养基及培养条件
• 2.2.1 大肠杆菌（E.coli）
• 2.2.2 黄单胞菌（Xcc）
• 2.3 菌种保藏
• 2.4 常用抗生素
• 2.5 常用溶液、缓冲液
• 2.6 细菌核酸的制备
• 2.6.1 细菌总DNA的提取
• 2.6.2 质粒的提取（碱裂解法）
• 2.6.3 细菌总RNA的提取
• 2.6.4 cDNA的合成
• 2.7 细菌总蛋白的制备
• 2.7.1 供试菌株的培养
• 2.7.2 胞内及培养液中的蛋白制备
• 2.8 凝胶电泳
• 2.8.1 琼脂糖凝胶电泳
• 2.8.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS PAGE）
• 2.9 Western印迹
• 2.9.1 转膜
• 2.9.2 封闭
• 2.9.3 抗原抗体反应
• 2.9.4 杂交检测
• 2.10 感受态细胞的制备和转化
• 2.10.1 电击法转化大肠杆菌
• 2.10.2 氯化钙法转化大肠杆菌
• 2.11 DNA操作
• 2.11.1 DNA片段的回收
• 2.11.2 DNA的酶切和连接
• 2.12 PCR扩增DNA片段
• 2.12.1 PCR引物的设计
• 2.12.2 PCR反应
• 2.12.3 反转录PCR（RT-PCR）
• 2.12.4 融合PCR
• 2.13 DNA测序
• 2.14 三亲本接合
• 2.15 突变体营养缺陷型检测
• 2.16 胞外酶的检测
• 2.16.1 胞外蛋白酶的检测
• 2.16.2 胞外淀粉酶的检测
• 2.16.3 胞外纤维素酶的检测
• 2.17 胞外多糖的检测
• 2.18 植物试验
• 2.18.1 致病性试验
• 2.18.2 过敏反应（HR）试验
• 2.19 细菌在培养基中的生长繁殖
• 2.20 细菌在寄主中的生长繁殖
• 2.21 整合突变体的构建
• 2.21.1 整合突变体的构建
• 2.21.2 整合突变体的验证
• 2.22 突变体的反式功能互补
• 2.23 候选效应物基因的表达构建
• 2.24 目的基因启动子报道基因构建
• 2.25 AvrBs3转运检测体系的建立
• 2.26 候选基因的转运检测构建
• 2.27 β-葡糖醛酸酶（GUS）活性测定
• 2.27.1 平板检测
• 2.27.2 定量测定
• 第三章 候选效应物基因的确立
• 3.1 引言
• 3.2 Xcc 8004中推测的无毒蛋白基因
• 3.2.1 注释的avr基因基本信息
• 3.2.2 Avr蛋白的结构域和理化特性分析
• 3.2.3 Avr蛋白的序列比对（BLAST）
• 3.3 推测的富含亮氨酸重复（LRR）蛋白基因
• 3.3.1 LRR基因的基本信息
• 3.3.3 LRR基因蛋白序列的结构域及理化特征分析
• 3.3.4 LRR蛋白的序列比对（BLAST）
• Ⅱ box的搜寻'>3.4 Xcc 8004基因组PIP-box和hrp_Ⅱbox的搜寻
• 3.5 讨论
• 第四章 突变体的构建与植株试验
• 4.1 引言
• 4.2 突变体的构建
• 4.2.1 Tn5gusA5插入突变体的筛选和验证
• 4.2.2 单交换整合突变体的构建
• 4.2.3 avr-hrpG双突变体的构建
• 4.3 突变体的表型检测
• 4.3.1 基本培养基生长情况
• 4.3.2 其它表型检测
• 4.4 突变体的致病性检测
• 4.4.1 avrBs2突变体的致病性显著降低
• 4.4.2 avrXccC是一个寄主特异牲基因
• 4.4.3 XC1553突变不影响Xcc在萝卜上的致病性
• 4.4.4 XC4273突变影响了Xcc的正常致病
• 4.5 XC1553是一个无毒基因
• 4.5.1 XC1553和XC4273突变体在拟南芥上的致病性
• 4.5.2 XC1553突变体在拟南芥叶片中的生长动态
• 4.6 在非寄主植物辣椒上的过敏反应
• 4.6.1 突变体在辣椒上的过敏反应测试
• 4.6.2 AvrBs1可以在辣椒ECW-10R上诱导HR反应
• 4.7 讨论
• 第五章 候选效应物基因的表达调控
• 5.1 引言
• 5.2 利用DNA芯片研究hrpG和hrpX调控元
• 5.2.1 Xcc 8004全基因组DNA芯片概况
• 5.2.2 芯片杂交结果中候选效应物基因的表达
• 5.3 五个avr基因是受hrpG调控的
• 5.4 四个avr基因是受hrpX调控的
• 5.5 XC1553和XC4273都是独立表达的基因
• 5.6 XC1553的表达受hrpG和hrpX调控
• 5.6.1 启动子报道基因的构建
• 5.6.2 启动子报道基因GUS活性检测
• 5.7 讨论
• 第六章 效应物蛋白的分泌和转运
• 6.1 引言
• 6.2 候选效应物基因的分泌检测
• 6.2.1 候选效应物基因的表达构建
• 6.2.2 Western杂交检测
• 6.3 候选效应物基因的转运研究
• 6.3.1 用AvrBs1作为报道蛋白鉴定效应物
• 6.3.2 用AvrBs3作为报道蛋白鉴定效应物
• 6.4 讨论
• 第七章 总结与结论
• 7.1 研究工作总结
• 7.1.1 项目来源
• 7.1.2 研究总结
• 7.1.3 存在问题和后续工作
• 7.2 结论
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 致谢
• 攻读博士学位期间完成的研究论文