长牡蛎（Crassostrea gigas）纤维素酶相关基因的克隆和表达分析

论文摘要

纤维素是葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键连接形成的生物大分子。是植物细胞壁的主要组成成份，是世界上含量最丰富的生物资源。纤维素的降解主要是依靠纤维素酶的作用。纤维素酶主要由以下三种酶组成：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素首先在内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的作用下被切断β-1，4-糖苷键形成纤维素糊精或者纤维二糖，然后在β-葡萄糖苷酶的作用下将纤维素糊精或者纤维二糖降解为葡萄糖。生物降解纤维素是各种酶的协同和逐步的反应，每种酶在纤维素的降解中都发挥着重要的作用。之前，一直认为只有微生物例如细菌和真菌能够降解和利用纤维素作为碳源。而高等动物是不能利用纤维素的，但是一些食草动物例外，例如反刍动物，它们利用纤维素是因为体内与之共生的微生物的作用。一直认为白蚁能够消化纤维素是依靠体内的共生菌，然而最新的研究发现，白蚁体内存在内源性的纤维素酶。这以发现也说明了不仅仅是微生物能够降解纤维素。之后，内源性的纤维素酶基因在许多昆虫和无脊椎动物中被发现。最近，在软体动物门中，也报道存在内源性的纤维素酶。并且已经在紫贻贝（Mytilus edulis）、皱纹盘鲍（Haliotis discushannai）、福寿螺（Ampullaria crossean）、日本河蚬（Corbicula japonica）体内发现了β-葡萄糖苷酶基因。但是还没有报道在长牡蛎体内存在纤维素消化酶。本实验通过同源克隆和cDNA末端快速扩增技术（RACE）成功地从长牡蛎体内克隆了内切葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因,并对基因的结构和表达特性进行了分析。1.长牡蛎内切葡聚糖酶基因的克隆和表达分析内切葡聚糖酶cDNA全长802bp，开放阅读框架630bp，编码209个氨基酸。基因组DNA全长5056bp，含有两段内含子长度分别为2053bp和2313bp。cDNA具有与已发现的内切葡聚糖酶基因相同的保守区结构和功能域，并且与其他已知贝类的内切葡聚糖酶有较高的同源性，含有糖基水解酶第45家族的保守结构域。利用RT-PCR方法研究了该基因在长牡蛎消化腺、外套膜、鳃、肌肉、性腺和唇瓣组织中的表达，发现内切葡聚糖酶基因只在消化腺中表达，而在其他组织中没有表达。2.长牡蛎β-葡萄糖苷酶基因的克隆和表达分析β-葡萄糖苷酶cDNA全长2052bp，开放阅读框架1347bp，编码448个氨基酸。cDNA具有与已发现的β-葡萄糖苷酶基因相同的保守区结构和功能域，并含有糖基水解酶第一家族（GHF-1）的保守区间。利用RT-PCR方法研究了该基因在长牡蛎消化腺、外套膜、鳃、肌肉、性腺和唇瓣组织中的表达，发现β-葡萄糖苷酶也仅在消化腺中表达，而在其他组织中不存在表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 纤维素和纤维素酶
• 1.1 纤维素简介
• 1.2 纤维素酶的组成
• 1.3 纤维素酶的分类
• 2 纤维素酶的作用机理
• 2.1 纤维素的降解过程
• 2.2 纤维素酶的催化机理
• 3 纤维素酶的研究现状
• 3.1 纤维素酶的研究现状
• 3.2 动物内源性纤维素酶的发现
• 3.3 贝类纤维素酶相关基因的发现
• 4 纤维素酶的应用进展
• 4.1 纤维素酶的应用现状
• 4.2 纤维素酶的应用前景
• 5 本实验研究的目的和意义
• 第二章 长牡蛎内切葡聚糖酶基因的克隆、表达及序列分析
• 0 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料的获取与处理
• 1.2 实验所用的引物
• 1.3 长牡蛎总 RNA 的提取过程
• 1.4 第一链 cDNA 的合成
• 1.5 长牡蛎β-葡聚糖苷酶基因核心片段的获得
• 1.6 内切葡聚糖酶基因的 3’UTR 的获得
• 1.7 内切葡聚糖酶基因的 5’UTR 的获得
• 1.8 长牡蛎内切葡糖酶基因的结构和特性分析
• 1.9 长牡蛎内切葡聚糖酶基因组 DNA 的获得与结构分析
• 1.10 长牡蛎内切葡聚糖酶基因的组织特异性表达
• 2 实验结果分析
• 2.1 总 RNA 的提取和检测
• 2.2 长牡蛎内切葡聚糖酶 cDNA 序列的分析
• 2.3 内切葡聚糖酶基因蛋白结构的分析
• 2.4 序列比对分析及系统进化树的构建
• 2.5 长牡蛎内切葡聚糖酶基因结构分析
• 2.6 内切葡聚糖酶基因在长牡蛎不同组织中的半定量分析
• 3 讨论
• 第三章 长牡蛎β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达与序列分析
• 0 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 长牡蛎 RNA 的提取和 cDNA 第一链的合成
• 1.2 实验所用引物
• 1.3 长牡蛎β-葡萄糖苷酶基因核心片段的获取
• 1.4 长牡蛎β-葡萄糖苷酶基因 3’UTR 的获得
• 1.5 长牡蛎β-葡萄糖苷酶基因 5’UTR 的获得
• 1.6 长牡蛎β-葡萄糖苷酶基因序列分析和基因结构预测
• 1.7 长牡蛎β-葡萄糖苷酶基因基因组 DNA 的获得与结构分析
• 1.8 长牡蛎β-葡萄糖苷酶基因的组织特异性表达
• 2 结果分析
• 2.1 长牡蛎β-葡萄糖苷酶基因 cDNA 结构分析
• 2.2 β-葡萄糖苷酶基因氨基酸序列和蛋白质结构的分析
• 2.3 序列比对分析和系统进化树的构建
• 2.4 长牡蛎β-葡萄糖苷酶基因组 DNA 结构分析
• 2.5 长牡蛎β-葡萄糖苷酶基因在不同组织中的表达差异分析
• 3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 学术成果