论文摘要
背景:牙周病是一种发病率较高的疾病,有患病人群范围大,波及广等特点,是导致牙齿缺失的最主要原因。该疾病不仅严重影响人们的咀嚼消化功能,还影响人们的美观,并是某些全身疾病的危险因素,所以牙周病以及牙周病的治疗一直是国内外学者研究的焦点。菌斑是引起牙周疾病的始动因子,主要由微生物集落、胞外基质、水性孔道和信号交流系统组成。牙周致病菌的表面物质、毒性代谢产物和机械运动等可直接或间接损伤牙周组织,引起组织细胞变性坏死、牙周纤维破坏、牙槽骨吸收等一系列损害,导致牙龈出血,牙周溢脓,牙周袋形成,牙齿松动脱落等症状。因此牙周病治疗的首要任务就是清除牙菌斑,去除牙周刺激因素。牙周病的基础治疗主要是应用机械清除牙菌斑,减少局部刺激因素,改善牙周微环境,但是由于部分牙周病变部位器械不能到达,使治疗效果不佳。因此药物治疗又成为治疗牙周病的辅助方法之一。由于牙周病有慢性、迁延的特点,加之致病菌耐药性的产生等,应用现有药物治疗该病都难以达到理想效果,所以寻找新的药物和新的用药途径日渐的受到人们的关注。前期我们针对牙周病特殊的病因及病理特点,筛选出以奥硝唑和甲磺酸培氟沙星合理配伍,制成了应用在牙周袋内的缓释制剂,在体外抑菌实验研究上取得了满意较效果。目的:为了下一步的临床试验,本研究对该缓释制剂进行了系列遗传毒性与细胞毒性的试验检测。遗传毒性研究是药物非临床安全评价的重要内容,它与其他毒理学研究特别是致癌研究与生殖毒性研究有密切的联系。细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件,不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理,在筛选药物时需做此项检测。该药物主要作用于人牙周膜细胞（HPDLC）,而此细胞是牙周组织的主要功能细胞,在创伤修复和组织再生中发挥着重要作用,本研究拟探讨缓释制剂对HPDLC的生物学活性的影响及毒性评价,为进一步临床试验提供实验依据。方法:一、复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星缓释制剂遗传毒性实验研究1、小鼠骨髓微核试验:将小鼠随机分组,实验组的药物浓度为10、5、2.5、1.25 g/kg,按0.4 ml/10g最大允许容积一次灌胃给药,同时设以给予同体积纯化水为阴性对照组和以腹腔注射40 mg/kg计量的环磷酰胺（CP）为阳性对照组。24 h后处死动物,取小鼠胸骨骨髓,常规制片,甲醇固定,Giemsa染色。显微镜（油镜）下观察微核率。2、组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验:采用组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100和TA102菌株用平板掺入法进行实验。实验将受试药品分为5个剂量（0.001μg/皿、0.01μg/皿、0.1μg/皿、1.0μg/皿和10μg/皿）,并分别以Dexon、NaN3、MMC为阳性对照,在有、无代谢活化剂S9的条件下对药物进行相关检测。二、复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星缓释制剂对人牙周膜细胞活性影响1、体外分离培养HPDLC:取12～15岁因正畸拔除的上颌第一前磨牙,组织块方法培养人牙周膜细胞原代细胞,传代备用。鉴定细胞来源。2、MTT法检测细胞增殖:取生长良好的第4代HPDLC,制备成浓度为4×107/L的细胞悬液,在96孔培养板中每孔接种细胞悬液200μl,接种8个培养板。待细胞贴壁后换液,每孔加以含1.25、2.5、5、10、20 g/L药物制剂的培养液培养,单纯加培养液作空白对照,每一浓度设4个平行孔,并同时设置调零组。每培养板分别继续培养0、1、2、3、4、5、6、7 d,对其进行MTT检测,判断本药物对细胞增殖的影响。对药物的细胞毒性进行评价。3、免疫荧光法检测Ki-67的表达取生长良好的第4代细胞,接种到预置盖玻片的24孔板内,接种密度为2000个/孔。每孔加以含1.25、2.5、5、10、20 g/L药物制剂的培养液培养,每一浓度设3个平行孔,单纯加培养液作空白对照。观察Ki-67在HPDLC中的阳性表达。4、流式细胞仪检测细胞周期:用分别含有1.25、2.5、5、10、20 g/L药物制剂的培养液培养生长良好的第4代细胞,单纯加培养液做空白对照。在细胞的对数生长期收获细胞,用流式细胞仪进行细胞周期检测。5、细胞凋亡检测:用分别含有1.25、2.5、5、10、20 g/L药物制剂的培养液培养生长良好的第4代细胞,单纯加培养液做空白对照。在细胞的对数生长期收获细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡百分比。三、复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星缓释制剂对人牙周膜细胞超微结构影响对HPDLC超微结构的影响:取第4代生长良好的细胞,按同种密度6.0×105/ml接种于培养瓶,分别加入含1.25、2.5、5、10、20 g/L药物制剂的培养液培养,单纯加培养液做空白对照,观察细胞生长状态,在其对数生长期收获细胞,对细胞进行固定、脱水、浸透、包埋、切片和染色等处理后,在TEM下观察HPDLC的超微结构。结果:一、遗传毒性试验结果1、微核实验结果显示各计量实验组与阴性对照组比较,微核数量没有明显变化。统计结果发现4个剂量的药物对小鼠的骨髓微核诱发率（‰）与阴性对照组比较均无显著差异（P>0.05）,P/N均>1;而经环磷酰胺诱导的阳性对照组与阴性对照组相比,微核明显增多,经比较差异显著（P<0.05）。2、在有或无S9（代谢活化剂）的条件下,TA97、TA98、TA100和TA102菌株分别在各个计量的实验组中与空白对照组相比较回变菌落没有明显变化,没有显著差异P>0.05,阳性对照组与空白对照组相比回变菌落明显增多,是自发回变菌落的2倍以上。二、对牙周膜细胞活性影响1、成功分离培养HPDLC,显微镜下观察,细胞呈长梭形或星形,胞突细长,胞体丰满,胞浆均匀,中央有圆形或椭圆型的胞核,细胞呈放射状、漩涡状排列。经鉴定证明此细胞为HPDLC。2、MTT分析,经单因素方差分析的结果显示1.25、2.5 g/L实验组OD值与对照组相比没有显著性差异;在5、10 g/L的药物浓度组在2-5 d,OD值明显增加与对照组相比有显著性差异（P<0.05）;而最高浓度20 g/L的实验组则对细胞增殖有一定的抑制作用,且相对增殖指数随时间变化逐渐减小,有2级细胞毒性。3、1.25、2.5 g/L实验组Ki-67的表达与对照组没有显著差别,而5、10 g/L实验组的Ki-67表达有明显增多,经单因素方差分析结果P<0.05;20 g/L实验组的表达率却有所下降。4、经FCM测试的实验组和对照组细胞周期结果:药物浓度为1.25、2.5 g/L实验组与对照组相比没有明显差异,对HPDLC各个周期变化没有显著影响;5、10 g/L药物浓度组细胞早的DNA合成前期所占比率（G1%）有所下降,而DNA合成期细胞所占比率（S%）则有所增高;且反映细胞增殖活力的增殖指数PrI值也有较明显的增高;最高浓度20 g/L药物组则是G1期有所升高,S期与G2期都有所下降。5、凋亡检测结果显示低浓度1.25、2.5 g/L的药物培养液对细胞生长没有明显影响,与对照组没有明显差别;中浓度5、10 g/L的药物浓度培养的细胞的凋亡比率较对照组稍小;而高浓度组20 g/L的药物浓度培养液则对细胞有一定的损伤,其细胞凋亡比率有所增加。三、超微结构观察通过电镜观察到1.25、2.5 g/L对细胞超微结构没有明显影响,其结果与对照组相似。表面细小突起较多。细胞核较小,位于一侧,核膜较清晰,核仁清晰,染色质结构较清晰。细胞质内细胞器丰富,大量内质网及泡状结构,线粒体较为发达,略显固缩。而5、10 g/L与对照组比较,表面突起较为粗大,内质网更为发达。而高浓度组20 g/L则对细胞的超微结构的改变有一定的作用,其与对照组比较细胞核形态结构及轮廓不清晰,染色质异常聚集。细胞突起较少,胞质内大量内质网囊腔因水肿而略显扩张,大量线粒体固缩。结论:1、复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星缓释制剂对小鼠以及组氨酸缺陷型菌株没有致突变作用,不存在明显的遗传毒性。2、复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星缓释制剂在培养液中浓度为5、10 g/L时对体外培养的HPDLC的增殖有一定的促进作用。3、20 g/L药物浓度的培养液对HPDLC有一定的毒性,可抑制其增殖,可促使细胞的凋亡。