论文摘要
增生性瘢痕是烧伤、整形乃至整个创伤修复领域亟待解决的难题之一,成纤维细胞是其发病的关键效应细胞,生长因子对成纤维细胞的增殖、分化具有重要的调控作用。结缔组织生长因子（CTGF）是新近发现的一种具有强烈促纤维化作用的生长因子,有研究证实[1],CTGF能促进体外增生性瘢痕成纤维细胞（HSF）增殖及其向肌成纤维细胞（MyoF）的转分化,但其细胞内信号转导机制尚不清楚,未见相关报道。JAK-STATs通路是近几年发现的细胞因子信息内传的非常重要的一条通路,是参与人体内部分生理（如造血）和病理反应（如部分肿瘤、类风湿性关节炎、脑损伤、支气管哮喘等）的共同通路之一,已证实与多种疾病发生发展及防治密切相关[2-5]。目前已知有多种细胞因子（如干扰素-α、β、γ,白细胞介素-2、4、6等）、生长因子（表皮生长因子、血小板衍生生长因子等）、生长激素、瘦素等通过JAK-STATs途径进行信号转导并调控部分细胞的增殖分化过程。鉴于以上原因,我们选择其作为参与CTGF调控人增生性瘢痕成纤维细胞增殖分化过程的信号通路进行筛选鉴定。方法:本研究通过原代培养人增生性瘢痕成纤维细胞,将对象分为①对照组:人增生性瘢痕成纤维细胞组;②CTGF刺激人增生性瘢痕成纤维细胞组。采用Western blot、免疫荧光化学染色、凝胶阻滞电泳（EMSA）、RT-PCR方法,分以下两大部分进行研究,第一大部分为JAK-STATs信号分子的初步筛选,包括①取0min、5 min、10 min、20 min、30 min、45 min、60 min、90 min八个时相点,采用western-blot方法检测各时相点JAK1、JAK2、JAK3、TYK2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6十类蛋白活化（磷酸化）情况,并筛选出对CTGF刺激其磷酸化程度呈反应性增高的蛋白（JAK1、STAT1）;②对筛选出来的蛋白（STAT1）用免疫荧光化学染色方法观察其胞浆到胞核的核转位的时相变化并比较组间差异;③利用凝胶阻滞电泳（EMSA）方法进一步验证此蛋白（STAT1）与DNA的结合能力及持续时间。第二大部分,将对象分为四组:①STAT1 ASODN+CTGF组;②CTGF刺激组;③STAT1 ASODN转染组;④空白对照组。在上述研究基础上,对筛选出的信号分子（STAT1）应用特异性抑制剂（STAT1 ASODN）进行阻断,用MTT法测定各组间细胞增殖差异, RT-PCR观察α-SMA的表达以反映人增生性瘢痕成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化情况,以了解STAT1对CTGF调控人增生性瘢痕成纤维细胞增殖分化过程的影响。结果:CTGF刺激人增生性瘢痕成纤维细胞后JAK-STATs通路所有蛋白（总蛋白以“t-”表示）均以非磷酸化和磷酸化（以“p-”表示）两种形式存在,在起始状态下即出现磷酸化条带,之后其磷酸化程度逐渐增强,在30min左右达峰值,再随时间延长逐渐下降呈一倒抛物线。Western blot显示胞浆及胞核中“p-JAK1/ t-JAK1”比值和“p-STAT1/ t-STAT1”比值随CTGF作用时间延长逐渐增大,至30min时达最强,之后逐渐下降。其余JAK-STATs蛋白虽均有不同程度的磷酸化,但并未随CTGF刺激出现反应性增强趋势。应用免疫荧光化学染色法检测STAT1的核转位,发现磷酸化STAT1蛋白在刺激30min左右达最强,比较组间差异发现:瘢痕成纤维细胞组（++）:荧光明亮,胞浆、胞核分布基本一致;CTGF刺激瘢痕成纤维细胞组（+++-++++）:荧光闪亮,呈明显的亮绿色,胞核中荧光强度增加,核聚集现象明显;应用凝胶阻滞电泳法,采用不同浓度CTGF刺激时发现检测STAT1与DNA的结合能力呈CTGF浓度依赖趋势,当CTGF 10ng/ml时达到峰值。同时,我们用10ng/ml CTGF刺激人增生性瘢痕成纤维细胞在不同时相点（0、10、20、30、45、60、90、120min）STAT1与DNA的结合能力及持续时间时发现:当CTGF刺激10min时,SIF已开始活化,45-60min达峰值,之后逐渐减弱,且较对照组明显增强。根据以上结果,初步筛选出JAK1、STAT1蛋白为参与CTGF调控人增生性瘢痕成纤维细胞增殖分化过程的信号分子。为进一步验证上述结论,我们将对象分为四组:①STAT1 ASODN+CTGF组;②CTGF刺激组;③STAT1 ASODN转染组;④空白对照组,观察STAT1对CTGF调控人增生性瘢痕成纤维细胞增殖分化过程的影响。在RT-PCR确定STAT1 ASODN已成功转入的前提下,用MTT测定转染前后细胞增殖程度变化时发现,增生性瘢痕成纤维细胞增殖程度呈②>④>①③的趋势变化,转染后细胞增殖明显受到抑制,结果具有统计学意义（P<0.05）。同时,我们采用RT-PCR比较转染前后a-SMA的差异,发现转染前后a-SMA/GAPDH条带灰度值无明显差异（P>0.05）,结果不具有统计学意义。结论:1、在CTGF促进人增生性瘢痕成纤维细胞增殖与转分化的同时,JAK1和STAT1蛋白被不同程度活化,其活化程度随CTGF的刺激反应性增强,胞核中磷酸化STAT1荧光强度明显增加,核聚集现象明显;STAT1与DNA的结合能力增强。2、STAT1 ASODN转染后人增生性瘢痕成纤维细胞增殖能力明显下降,但并未完全抑制其增殖过程;3、STAT1 ASODN转染后人增生性瘢痕成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化能力则未见明显改变。以上研究结果提示:STAT1参与了CTGF调控人增生性瘢痕成纤维细胞增殖过程,但并非是唯一途径;而JAK1则可能作为其上游因子,通过JAK1-STAT1通路参与了CTGF促进人增生性瘢痕成纤维细胞增殖过程。这从一定程度上揭示了CTGF调控人增生性瘢痕成纤维细胞增殖过程的信号转导机制,从而为抑制瘢痕纤维化提供了新的研究方向,有助于更深入地调控CTGF的促纤维化作用,为增生性瘢痕及其它纤维化疾病的研究及防治提供新的思路。
论文目录
相关论文文献
- [1].JAK-STATs通路在CTGF刺激人增生性瘢痕成纤维细胞增殖分化中的作用[J]. 中国美容医学 2008(11)
- [2].白杨素通过JAK-STATs信号通路抑制内毒素诱导的巨噬细胞炎症反应[J]. 南方医科大学学报 2018(03)
- [3].JAK-STATs信号转导通路在HNSCC中的研究进展[J]. 临床口腔医学杂志 2011(08)
- [4].IFN-α诱导的信号传导通路的研究进展[J]. 中国现代普通外科进展 2012(07)
标签：结缔组织生长因子论文; 人增生性瘢痕论文; 成纤维细胞论文; 肌成纤维细胞论文; 增殖论文; 转分化论文; 平滑肌肌动蛋白论文;