柑桔溃疡病菌重组单链抗体的高效表达及稳定性改造

论文摘要

柑桔溃疡病（citrus bacterial canker disease, CBCD）是影响全球柑桔种植业发展的重大检疫性病害,其病原菌为地毯草黄单胞柑桔致病变种（Xanthomonas axonopodis pv. citri）,是国内外重大检疫性有害生物。长期以来由于缺乏抗病品种和特效的化学防治药剂,对该病的防治主要采取加强非疫区建设与植物检疫来严防病害的传播,对病树采取挖除并集中烧毁的根除措施。目前国内外正在实施的柑桔非疫生产区建设,强化植物检疫,严防疫害传入的监控策略,迫切需要建立快速、特异、准确的诊断技术及防控措施。基因工程重组单克隆抗体（recombination monoclonal antibody, RMA）是90年代以来,人们利用基因工程重组技术,有目的地在基因水平上对抗体分子进行切割、拼接或修饰,或者直接合成基因序列,再将重组DNA或重组蛋白基因导入细胞表达产生的一类抗体,兼具治疗和诊断双重功能。利用抗原-抗体特异性结合原理,可用于人类疾病、植物病害的诊断、治疗和预防。单链抗体（single chain variable fragment, ScFv）是利用基因工程的方法用一连接肽将抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）拼接在一起的重组蛋白,由于其低或无免疫原性、分子量小、组织穿透力强,成本低,可大规模生产等特点已广泛应用于医学领域。但是,国内外单链抗体ScFv应用于植物病害方面的研究报道寥寥无几,且抗柑桔溃疡病菌的重组基因工程抗体高表达体系的建立以及稳定性改造方面的研究尚未见报道。本研究的目的就是针对现有的柑桔溃疡病快速检测技术体系尚未完善,并且传统上柑桔溃疡病的检测方法如PCR,噬菌体检测法、酶联免疫吸附法（ELISA）和斑点免疫结合法（DIA）等在一定程度上存在着检测周期长、操作复杂、灵敏度不高,不能很好的满足检疫工作的要求的缺点,应用高产重组单链抗体结合胶体金技术为柑桔溃疡病菌XAC的免疫诊断和防治研究提供新的工具和途径。研究内容主要包括:运用PCR方法扩增利用核糖体展示技术筛选的抗柑桔溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis pv.citri, XAC）的单链抗体（ScFv 95）基因片段,将单链抗体基因重组到原核表达载体pET30a（+）中,构建单链抗体高效表达载体pET30a（+）-XAC-ScFv。再将pET30a（+）-XAC-ScFv质粒转化进大肠杆菌BL21（DE3）后诱导表达,并对表达产物进行纯化、复性及活性检测,随后对抗体的稳定性进行初步改造从而为柑橘溃疡病菌的血清学诊断提供新型的诊断试剂,而且还可用于进一步研究柑橘溃疡病菌与寄主的初步识别机制,为柑橘溃疡病菌的生物防治提供理论依据。论文主要研究结果如下:①成功扩增抗柑桔溃疡病菌的单链抗体ScFv基因,将其进行酶切后与载体pET30a（+）相连并转化进了大肠杆菌BL21（DE3）中。②采用IPTG诱导的包涵体表达方式进行抗体的表达,将包涵体裂解物进行SDS-PAGE电泳,显示在32 kDa处有一蛋白条带产生。将表达产物采用His-tag蛋白纯化试剂盒纯化后进行SDS-PAGE显示,在32 kDa同样有一蛋白条带产生。为了进一步验证表达的蛋白即目的蛋白,将表达产物进行了Western blot杂交,结果显示,与纯化后的电泳结果一致,在32 kDa处有单一的条带产生,说明表达纯化的蛋白即目的蛋白。③采用凝胶（Sephacryl-200HR）柱上在位复性对蛋白进行活性再生,通过斑点杂交检测复性后蛋白的活性,结果显示蛋白通过凝胶层析复性已成功获得原有的生物功能。提取柑橘溃疡病菌LPS及柑橘溃疡病菌近源种甘蓝黑腐病菌（XCC）LPS、水稻条斑病菌（XOO）LPS、水稻白叶枯（XOOc）LPS,LPS用HEPPES缓冲液（10 mmol/L HEPES,100 mmol/L NaCL pH 7.4）稀释成5μg/ml,以30μL/min注入。用Biacore evauation软件分析单链抗体亲和力,分析结果显示复性后的重组抗体只跟柑橘溃疡病菌LPS具有较高的结合力,亲和常数KA（ka / kd）达到了2.72×107M-1。④通过重叠延伸PCR成功将半胱氨酸引入到了ScFv基因的VH和VL链中,为构建抗柑橘溃疡病菌的稳定型重组单链抗体的后续工作做了充足的准备。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 抗体简介
• 1.1.1 抗体的基本结构
• 1.1.2 单链抗体基因的构建
• 1.1.3 单链抗体的表达及复性
• 1.1.4 抗体的纯化
• 1.1.5 单链抗体的稳定性
• 1.2 柑橘溃疡病菌简介
• 1.2.1 柑桔溃疡病的发生与危害
• 1.2.2 柑桔溃疡病菌的基因组研究
• 1.2.3 柑桔溃疡病菌的检疫检验技术
• 1.2.4 病害根除计划与检疫除害
• 1.3 研究的目的和意义
• 1.4 研究的目标和内容
• 1.5 整体设计思路
• 1.6 创新之处
• 2 SCFV 克隆、表达及纯化
• 2.1 技术路线
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 主要仪器
• 2.2.2 主要试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 筛选后单链抗体库DNA 的扩增
• 2.3.2 ScFv 基因的克隆
• 2.3.3 单链抗体ScFv 表达
• 2.3.4 XAC-ScFv 表达产物的纯化
• 2.3.5 表达产物的检测
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 阳性克隆子验证
• 2.4.2 SDS-PAGE 检测表达与纯化结果
• 2.4.3 Western blot
• 2.5 讨论
• 2.5.1 单链抗体的表达
• 2.5.2 单链抗体的纯化与鉴定
• 3 重组单链抗体的复性及活性测定
• 3.1 技术路线
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 主要仪器
• 3.2.2 主要试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 凝胶柱层析复性
• 3.3.2 斑点杂交测定单链抗体活性
• 3.3.3 Biacore 分析单链抗体亲和力
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 分子筛层析复性的抗体
• 3.4.2 斑点杂交测定抗体活性
• 3.4.3 Biacore 测定抗体亲和力
• 3.5 讨论
• 3.5.1 单链抗体的复性
• 3.5.2 斑点杂交测定抗体活性
• 3.5.3 Biacore 亲和力测定
• 4 稳定型重组单链抗体构建
• 4.1 技术路线
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 主要仪器
• 4.2.2 主要试剂
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 VH 和VL 引入半胱氨酸位点
• 4.3.2 VH 和VL 基因的克隆
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 VH 和VL 基因的验证
• 4.4.2 阳性克隆子验证
• 4.5 讨论
• 4.5.1 半胱氨酸位点的引入
• 4.5.2 稳定型重组抗体的构建表达
• 5 主要研究结论及后续研究建议
• 5.1 主要研究结论
• 5.2 后续工作建议
• 致谢
• 参考文献
• 附录