兔支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及其外膜蛋白免疫效果的研究

论文摘要

兔支气管败血波氏杆菌病是由支气管败血波氏杆菌引起的一种常见兔呼吸道疾病。主要引起哺乳仔兔和断乳仔兔的急性死亡,成年兔的鼻炎、支气管炎和脓疱性肺炎等,对养兔业造成很大的危害。2006年以来,山东省某一大型兔场（饲养新西兰肉种兔2400余只）,所产仔兔（共计465只）,均在20～30日龄发病,表现为精神不振,多数病兔鼻腔流出脓性鼻液,周围的被毛沾有粘液脓性分泌物,后期出现结痂,随着病程的延长,逐渐表现为呼吸困难,并出现鼻鼾声,体况瘦弱,下痢拉稀。为了进一步探讨引起该规模化兔场呼吸道疾病的原因,本研究通过病原学检查,对主要病原进行了分离鉴定和分子生物学特性的研究,同时对分离到主要病原菌的外膜蛋白提取后进行了免疫原性研究,为规模化种兔场呼吸道疾病的防治提供了理论依据。本研究共分2部分:一、兔支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及其分子生物学特性的检测2006年,山东省某一大型养兔场的20～30日龄的幼兔突然大批发病死亡。病兔早期精神不振,多数病兔鼻腔流出脓性鼻液,随着病程的延长逐渐表现为呼吸困难,并出现鼻鼾声,以体况瘦弱,下痢拉稀为主要症状。从中主要分离到4株细菌,根据其形态学特性、培养特性、生化特性、血清学反应特性等可将分离菌鉴定为兔支气管败血波氏杆菌。然后对所分离到的兔支气管败血波氏杆菌P13菌株进行（G+C）mol%含量的测定以及16SrRNA的扩增,结果（G+C）mol%含量为61.7～62.4%,与Kersters K结果相符（61.6～62.6%）;而该菌16SrRNA核苷酸序列与Genbank中收录的AF177666株禽波氏杆菌菌株核苷酸序列同源性为82.7%,与本实验室保存的兔支气管败血波氏杆菌菌株P11菌株及参考菌株同源性高,分别为99.7%和99.9%。最后利用所分离到的兔支气管败血波氏杆菌菌株制备免疫原,通过免疫仔兔,使仔兔获得抗体,而使幼仔兔获得保护,并且效果较好。二、兔支气管败血波氏杆菌外膜蛋白的提取及其免疫效果的检测本研究以小鼠为实验动物模型,研究支气管败血波氏杆菌的外膜蛋白（OMP）和其中的有效保护抗原成分（OMP68）的免疫原性及免疫保护作用。本研究利用改进的Wooldridge的方法提取了支气管败血波氏杆菌P11和P13的OMP,利用SDS-PAGE电泳比较了两株之间差异,采用Western- blotting进行了分析并确定了P13菌株OMP（P13-OMP）中的有效保护性抗原成分,采用电洗脱方法获得分子量为68 KD的P13-OMP中的有效保护抗原成分（OMP68）,然后制备了油乳剂P13的全菌、P13-OMP和OMP68免疫抗原。抗体动态变化:将清洁级小鼠70只随机分成7组,10只/组,用油乳剂P13的全菌和不同剂量的P13-OMP和OMP68免疫抗原分别免疫,采用间接ELISA检测免疫小鼠的相应抗体水平并分析抗体动态变化;主动免疫保护试验:将清洁级小鼠80只随机分成8组,10只/组,分别采用制备的油乳剂P13-OMP（OMP25μg/只）、OMP68（25μg/只）和P13菌体免疫抗原在免疫10d后,分别用100 LD50的P11和P13腹腔攻毒,然后统计保护率并分析免疫原所提供的免疫保护力。免疫P13-OMP和OMP68油乳剂抗原后,7d时,抗体水平开始逐渐上升,42d时,抗体水平分别达到215.3和214.8,然后逐渐下降,70d时,抗体水平分别达到29.1和210.2。主动免疫时,P11和P13攻毒的P13-OMP免疫组分别均得到9/10和9/10的保护,OMP68免疫组分别均得到9/10和10/10的保护,而P13全菌免疫组分别得到4/10和6/10保护,对照组全部死亡。P13-OMP和OMP68抗原均具有良好的免疫原性和免疫保护作用,为支气管败血波氏杆菌OMP亚单位疫苗的研制奠定了良好的理论基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1. 兔支气管败血波氏杆菌病的研究现状
• 1.1 支气管败血波氏杆菌病的病原学
• 1.2 支气管败血波氏杆菌病的流行病学
• 1.3 支气管败血波氏杆菌病的临诊症状和病理变化
• 1.4 支气管败血波氏杆菌的致病性
• 1.5 支气管败血波氏杆菌病的的诊断方法
• 1.6 支气管败血波氏杆菌病的防治措施
• 2. 细菌鉴定的分子遗传学方法
• 2.1 16sRNA 测序方法
• 2.2 DNA G+C mol%含量测定方法
• 2.3 核酸杂交技术
• 2.4 限制性核酸内切酶分析法
• 2.5 质粒图谱分析法
• 2.6 脉冲场凝胶电泳分析法
• 2.7 PCR 技术
• 2.8 微生物全基因组测序
• 3. 细菌外膜蛋白的研究现状
• 3.1 细菌外膜蛋白的生理功能
• 3.2 细菌外膜蛋白的免疫原性
• 3.3 细菌外膜蛋白的致病作用
• 3.4 细菌外膜蛋白与血清型
• 4. 支气管败血波氏杆菌OMP 国内外研究现状
• 5. 本研究的内容、目的及意义
• 试验一：兔支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及其分子生物学特性的检测
• 摘要
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 被检病料及被检血清
• 1.1.2 主要培养基
• 1.1.3 参考菌株及阳性血清
• 1.1.4 药敏纸片
• 1.1.5 试验用兔
• 1.1.6 化学试剂
• 1.1.7 分子生物学材料
• 1.1.8 仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 细菌的分离及鉴定
• 1.2.2 分离菌免疫原性的检测
• 1.2.3 分离菌部分分子生物学特性的检测
• 2. 结果
• 2.1 细菌的分离鉴定
• 2.2 分离菌免疫原性的检测
• 2.3 分离菌部分分子生物学特性
• 2.3.1 （G＋C）mol％测定
• 2.3.2 16SrRNA 序列测定及同源性分析
• 3. 讨论
• 试验二：支气管败血波氏杆菌外膜蛋白的提取及其免疫效果的检测
• 摘要
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要菌株
• 1.1.2 试验动物
• 1.1.3 主要培养基
• 1.1.4 主要试剂和仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 支气管败血波氏杆菌OMP 的提取
• 1.2.2 支气管败血波氏杆菌OMP SDS-PAGE 电泳
• 1.2.3 支气管败血波氏杆菌OMP Western-blotting 分析
• 1.2.4 支气管败血波氏杆菌OMP68 的纯化
• 1.2.5 抗体动态检测
• 1.2.6 主动免疫保护效果检测
• 2. 结果
• 2.1 支气管败血波氏杆菌OMP SDS-PAGE 电泳结果
• 2.2 支气管败血波氏杆菌OMP Western-blotting 结果
• 2.3 支气管败血波氏杆菌OMP68 的纯化和鉴定结果
• 2.4 抗体动态检测结果
• 2.5 主动免疫保护试验结果
• 3.讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 附图