骨髓间充质干细胞移植治疗薄型子宫内膜的实验研究

论文摘要

第一章大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定目的：建立一种简便稳定的体外分离、扩增及鉴定Sprague-Dawley（SD）大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）的方法。方法：采用全骨髓细胞贴壁培养法体外分离、培养和扩增雄性SD大鼠的BMSCs,应用MTT方法检测其生长曲线,流式细胞仪检测BMSCs表面标记,向骨细胞、脂肪细胞定向诱导分化,对培养、纯化的BMSCs进行鉴定,并冻存和解冻BMSCs,观察生长状态。结果：全骨髓贴壁培养法获得的BMSCs可贴壁生长,原代细胞呈椭圆形,集落式生长,经过传代,细胞形态趋于一致,呈纤维细胞样生长。P1,P3,P5BMSCs生长曲线呈S型,生长迅速；细胞表面抗原CD90表达为阳性,CD34,CD45表达为阴性；在适宜的诱导条件下,BMSCs可成功分化为骨细胞、脂肪细胞；经过冻存复苏后的BMSCs生长特点与未冻存BMSCs无明显差异。结论：全骨髓贴壁法分离培养的BMSCs体外扩增能力强,纯度高,可用于进一步研究,是获得BMSCs的简便高效的方法。第二章SD大鼠薄型子宫内膜模型的建立和鉴定目的：建立并鉴定大鼠薄型子宫内膜模型,为临床开展干细胞移植提供实验基础。方法：1.220-280g未交配雌性SD大鼠12只随机分为两组。造模组用无水乙醇宫腔内注射约5min,对照组给予生理盐水。2.于术后三个动情周期,行HE染色观察子宫内膜组织形态变化,测量子宫内膜厚度,免疫组化检测子宫内膜细胞标志蛋白角蛋白、波形蛋白及子宫内膜容受性标志蛋白整合素γ3的表达情况。结果：1.造模组大鼠子宫内膜腺体稀疏,基质水肿,部分区域肉芽组织样增生,厚度明显薄于对照组（P<0.05）。2.子宫内膜细胞角蛋白,波形蛋白,子宫内膜容受性标志蛋白整合素p3表达明显低于对照组（P<0.05）。结论：无水乙醇宫腔内注射可成功有效建立薄型子宫内膜薄型,建模成功率100%。第三章骨髓间充质干细胞移植对薄型子宫内膜的作用及其机制目的：探讨BMSCs移植对薄型子宫内膜的治疗作用及可能的作用机制。方法：1.联合采用BrdU体外标记和大鼠性别决定基因Sry对移植细胞进行体内示踪。选择健康性成熟雌性SD大鼠72只,随机分为正常对照组（正常大鼠不予任何处理,n=12）,PBS对照组（模型鼠给予PBS移植,n=12）,静脉早移植组（于建立模型6-8小时后经尾静脉移植BMSCs1×107/只,n=12）,宫腔早移植组（于建立模型6-8小时后宫腔原位移植BMSCs1×107/只,n=12）,静脉晚移植组（于建立模型12天后经尾静脉移植BMSCs1×107/只,n=12）,宫腔晚移植组（于建立模型12天后宫腔原位移植BMSCs1×107/只,n=12）。于移植后12天处死大鼠并留子宫内膜组织标本。2.HE染色检测子宫内膜组织结构,测量子宫内膜厚度;免疫组化方法及免疫印迹法检测子宫内膜细胞标志蛋白角蛋白、波形蛋白和CD34的表达,以及子宫内膜容受性标志蛋白整合素αvβ3和LIF的表达。3.免疫组织化学法及免疫印迹法检测各组子宫内膜BrdU的表达,PCR技术检测子宫内膜Sry基因的表达情况；RT-PCR检测VEGFmRNA、bFGFmRNA、TNF-amRNA、IL-1βmRNA、IL-6mRNA的表达。结果：1.BMSCs移植后12天子宫内膜HE观察与PBS对照组相比,各细胞移植组的子宫内膜均不同程度增厚,腺体数目增多,基质均一,水肿程度减轻,但仍未达到正常对照组水平。2. BMSCs移植后12天子宫内膜厚度测量与PBS对照组相比,其余5组子宫内膜显著增厚,差异均有统计学意义（P<0.05）；其中宫腔早移植组,静脉晚移植组稍薄于正常对照组,差异无统计学意义（P>0.05）,而静脉早移植组,宫腔晚移植组的子宫内膜显著薄于正常对照组,差异有统计学意义（P<0.05）；各细胞移植组相比,差异无统计学意义（P>0.05）。3. BMSCs移植后12天子宫内膜角蛋白的表达免疫组化结果示：各细胞移植组角蛋白平均光密度值均显著大于PBS对照组（P<0.01）,但小于正常对照组（P<0.05）,各细胞移植组间的角蛋白平均光密度值无明显差异（P>0.05）。免疫印迹结果示：各细胞移植组角蛋白灰度值均大于PBS对照组（P<0.05）,而小于正常对照组（P<0.05）；灰度值在静脉早移植组、静脉晚移植组、宫腔早移植组,宫腔晚移植组依次升高,但组与组之间两两比较,差异无统计学意义（P>0.05）。4. BMSCs移植后12天子宫内膜波形蛋白的表达免疫组化结果示：各组波形蛋白平均光密度值均明显高于PBS对照组（P<0.05）；四个细胞治疗组相比,静脉晚移植组小于其余三组（P<0.05）,其余三组两两相比,差异无意义（P>0.05）。免疫印迹结果示：四个细胞移植组均明显高于PBS对照组,而显著小于正常对照组（P<0.05）；灰度值在宫腔早移植组,静脉早移植组,宫腔晚移植组,静脉晚移植组依次升高,但差异无统计学意义（P>0.05）。5. BMSCs移植12后子宫内膜CD34的表达免疫组化结果示：各细胞移植组平均光密度值高于正常对照组,除静脉晚移植组与其比较无差异外,其余三组与之比较均有统计学差异（P<0.05）。与PBS对照组相比,宫腔晚移植组和静脉早移植组明显升高（P<0.05）,而静脉晚移植组和宫腔早移植组平均光密度值降低,差异无统计学意义（P>0.05）。免疫印迹结果示：各细胞移植组灰度值高于正常对照组；其中宫腔晚移植组和静脉早移植组显著高于正常对照组和PBS对照组（P<0.05）,同时也高于静脉晚移植组和宫腔早移植组,但差异无统计学意义（P>0.05）。6. BMSCs移植后12天子宫内膜容受性标志物整合素avβ3的表达免疫组化结果示：PBS对照组平均光密度值最小,正常对照组最大,宫腔晚移植组稍高于PBS对照组（P>0.05）,其余组均显著高于PBS对照组（P<0.05）；与正常对照组相比,各组的平均光密度值显著降低（P<0.05）。宫腔晚移植组,宫腔早移植组,静脉早移植组依次升高,两两比较均有显著差异（P<0.05）。免疫印迹结果示：整合素αv+β3的灰度值在PBS对照组中最低,正常对照组最高；与PBS对照组相比,其余各组值均显著增高（P<0.05）；细胞移植组的灰度值均小于正常对照组,差异有统计学意义（P<0.05）；四组细胞移植中,整合素αv在静脉晚移植,静脉早移植,宫腔晚移植组,宫腔早移植组依次降低,两两比较具有显著性差异（P<0.05）。整合素β3灰度值在静脉晚移植组,宫腔早移植组,宫腔晚移植组,静脉早移植组依次降低,其中后两者相比无统计学差异（P>0.05）,其余各组比较均有显著性差异（P<0.05）。7. BMSCs移植后12天子宫内膜容受性标志物LIF的表达免疫组化结果示：与PBS对照组相比,其余各组平均光密度值显著升高（P<0.05）；各细胞移植组平均光密度均小于正常对照组,但差异无统计学意义（P>0.05）；四个细胞移植组之间相比,差异均无统计学意义（P>0.05）。免疫印迹结果示：LIF灰度值在正常对照组中最高,PBS对照组最低；灰度值在宫腔晚移植组,静脉晚移植组,宫腔早移植组,静脉早移植组依次降低,各组之间比较,差异有统计学意义（P<0.05）。8. BMSCs移植后12天子宫内膜BMSCs的示踪和定位Sry基因表达：提取各组子宫内膜组织细胞的总DNA,用PCR技术检测子宫内膜中Sry的表达,结果示在各组大鼠子宫内膜组织中均未检测到Sry基因的表达。BrdU的表达：BrdU在宫腔早移植组,静脉早移植组,宫腔晚移植组,静脉晚移植组依次增强,静脉晚移植组显著强于宫腔早移植组（P<0.05）,而与静脉早移植组和宫腔晚移植组之间的差别无统计学意义（P>0.05）,PBS对照组和正常对照组大鼠子宫内膜组织中未能检测到BrdU染色阳性细胞。9.BMSCs移植后12天子宫内膜组织中VEGFmRNA、 bFGFmRNA、IL-1βmRNA、TNF-amRNA、IL-6mRNA的表达VEGFmRNA RT-PCR结果示：宫腔晚移植组表达最低,静脉晚移植组表达最高,其次为PBS对照组,静脉早移植组,正常对照组,宫腔早移植组,但组与组相比,差异无统计学意义（P>0.05）。bFGFmRNA RT-PCR结果示：bFGFmRNA在PBS对照组和静脉晚移植组表达相似,显著高于其他各组,其次为宫腔晚移植组,静脉早移植组,宫腔早移植组,正常对照组。静脉早移植组和宫腔早移植组表达无差异（P>0.05）。IL-1pmRNA RT-PCR结果示：正常对照组表达最低,PBS对照组表达最高,IL-1pmRNA在静脉早移植组和宫腔早移植组子宫内膜中表达低于晚移植组,差异有统计学意义（P<0.05）。在早移植或晚移植细胞组内,不同移植途径之间IL-1pmRNA的表达无明显差异（P>0.05）。TNF-amRNA RT-PCR结果示：TNF-amRNA在宫腔晚移植组,正常对照组,静脉晚移植组,PBS对照组,静脉早移植组,宫腔早移植组依次增强,但差异无统计学意义（P>0.05）。IL-6mRNA RT-PCR结果示：正常对照组表达最低,PBS对照组其次,四个细胞移植组IL-6mRNA表达高于正常对照组和PBS对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：1. BMSCs移植于薄型子宫内膜大鼠体内,在不同程度上可促进子宫内膜细胞再生,修复子宫内膜组织,改善子宫内膜容受性,提示BMSCs移植治疗薄型子宫内膜是可行的。2.经两个移植途径和两个移植时机移植BMSCs对薄型子宫内膜均有不同程度的治疗效果,还需进一步的研究来选择最佳移植途径和移植时机。3.子宫内膜组织中有BrdU阳性表达细胞,BMSCs移植后可迁移归巢到损伤局部组织,可能是治疗薄型子宫内膜的机制之一；4. BMSCs移植后大鼠子宫组织中生长因子VEGFmRNA bFGFmRNA及抑炎因子IL-6mRNA表达上调,而促炎因子TNF-amRNA、IL-1βmRNA的表达下调,提示移植入体内的BMSCs可能通过自身分化或旁分泌或免疫调节机制促进薄型子宫内膜的修复。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定
• 第一节 目的和意义
• 第二节 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要实验设备
• 2.1.3 主要实验试剂
• 2.1.4 常用溶液及其配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大鼠BMSCs的分离培养、传代和冻存
• 2.2.2 大鼠BMSCs的生长曲线和鉴定
• 第三节 实验结果
• 3.1 大鼠BMSCs的体外培养
• 3.2 大鼠BMSCs的冻存和复苏
• 3.3 大鼠BMSCs生长曲线
• 3.4 大鼠BMSCs的表面标记
• 3.5 大鼠BMSCs向骨细胞及脂肪细胞诱导分化
• 第四节 讨论
• 4.1 大鼠BMSCs的分离及培养
• 4.2 大鼠BMSCs的冻存和复苏
• 4.3 大鼠BMSCs的生物学特征
• 4.3.1 大鼠BMSCs的体外生长特点
• 4.3.2 大鼠BMSCs的表面标记
• 4.3.3 大鼠BMSCs的多向分化潜能
• 第五节 结论
• 第二章 SD大鼠薄型子宫内膜模型的构建和鉴定
• 第一节 目的和意义
• 第二节 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 实验设备和仪器
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 主要试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大鼠薄型子宫内膜模型建立
• 2.2.2 HE染色
• 2.2.3 免疫组织化学检测角蛋白、波形蛋白、及整合素β3的表达
• 2.2.4 实验结果测定
• 2.2.5 统计学分析
• 第三节 结果
• 3.1 实验大鼠一般情况
• 3.2 子宫大体标本观察
• 3.3 大鼠子宫内膜HE染色观察
• 3.4 大鼠子宫内膜细胞标志蛋白的表达
• 3.5 子宫内膜容受性标志蛋白整合素p3的检测
• 第四节 讨论
• 4.1 SD大鼠薄型子宫内膜的建立
• 4.2 SD大鼠薄型子宫内膜模型的鉴定
• 4.2.1 薄型子宫内膜形态学观察
• 4.2.2 薄型子宫内膜细胞标志蛋白的表达
• 4.2.3 子宫内膜容受性评估
• 第五节 结论
• 第三章 骨髓间充质干细胞移植对薄型子宫内膜的作用及其机制
• 第一节 目的和意义
• 第二节 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大鼠BMSCs的培养和标记
• 2.2.2 大鼠薄型子宫内膜模型的建立
• 2.2.3 实验动物分组,处理及标本收集
• 2.2.4 大鼠BMSCs移植对薄型子宫内膜的作用
• 2.2.5 大鼠BMSCs对薄型子宫内膜作用机制的探讨
• 2.2.6 统计学分析
• 第三节 结果
• 3.1 实验大鼠一般情况
• 3.2 大鼠BMSCs对薄型子宫内膜的作用
• 3.2.1 大鼠子宫内膜HE染色形态学变化
• 3.2.2 子宫内膜厚度的测量
• 3.2.3 子宫内膜细胞标志蛋白的表达
• 3.2.4 大鼠子宫内膜微血管密度
• 3.2.5 BMSCs移植对薄型子宫内膜容受性的作用
• 3.3 大鼠BMSCs移植对薄型子宫内膜的作用机制
• 3.3.1 大鼠BMSCs移植后的示踪和定位
• 3.3.2 子宫内膜组织中细胞因子及炎症介质的检测
• 第四节 讨论
• 4.1 BMSCs的标记
• 4.2 BMSCs对薄型子宫内膜的治疗作用
• 4.3 BMSCs对薄型子宫内膜作用的可能机制
• 4.4 BMSCs移植的途径及时机
• 4.4.1 BMSCs移植的途径
• 4.4.2 BMSCs移植的时机
• 4.5 BMSCs的安全性
• 4.6 与其他BMSCs治疗疾病效果比较分析原因
• 4.7 干细胞移植治疗薄型子宫内膜的进一步研究方向
• 第五节 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 攻读学位期间主要的研究成果
• 致谢