骨髓间充质干细胞在小鼠急性肾衰竭修复中的作用

论文摘要

目的:建立顺铂致小鼠急性肾衰竭（ARF）模型,观察外源性骨髓间充质干细胞（MSC）输注后ARF小鼠肾功能改变,MSC在肾组织的分布及是否向肾小管上皮细胞分化,肾组织生长因子、炎症因子和抗炎因子的表达,探讨MSC在ARF修复中的作用及其机制,为干细胞治疗ARF提供理论和实验依据。方法:贴壁法分离绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠的MSC,体外扩增3代后,流式细胞仪鉴定,取第3代MSC备用。90只雌性小鼠随机分为三组:（1）正常对照（Control）组（n=18）:观察正常小鼠肾功能和肾脏结构;（2）急性肾衰竭（ARF）组（n=36）:顺铂用生理盐水稀释成1mg/ml,以12.7mg/kg剂量皮下注射,建立ARF模型,24小时后经尾静脉输注生理盐水;（3）骨髓间充质干细胞（MSC）组（n=36）:同上方法建立ARF模型,24小时后经尾静脉输注GFP小鼠MSC的第3代细胞悬液（2×106/ml）。建模后第0、1、4、7、14、28天随机选取ARF组和MSC组小鼠各6只,处死后收获血标本和肾脏标本。全自动血生化分析仪检测肾功能指标血尿素氮（BUN）和血肌酐（Scr）;肾脏标本常规病理切片, HE染色观察组织学变化, RT-PCR和免疫组化方法检测HGF、BMP-7、TNF-α、IL-10 mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜下观察GFP阳性的MSC（GFP+MSC）在肾组织的分布,megalin荧光组化方法在激光共聚焦显微镜下观察MSC向肾小管上皮细胞的分化情况。结果:（1）流式细胞仪显示体外分离培养的第3代GFP小鼠MSC表面抗原表达:CD44阳性细胞表达率97.8%±0.9%,CD90阳性细胞表达率96.8%±1.4%, CD29阳性细胞表达率97.6%±2.4%,而CD11b/c阳性细胞表达率13.2%±0.6%, CD34阳性细胞表达率1.2%±0.5%。（2）顺铂注射4天后,MSC组BUN、Scr值分别为68.69±7.62 mmol/L和179.0±25.4μmol/L,与ARF组（BUN、Scr值分别为86.96±6.71mmol/L、244.5±34.5μmol/L）相比明显降低（P﹤0.01）,在第7和14天,仍可见MSC组的BUN、Scr水平低于ARF组（P﹤0.01,P﹤0.05）。第7、14天MSC组小鼠肾小管损伤组织学评分与相应时间点ARF组小鼠相比有显著差异（P﹤0.05）。（3）MSC组BMP-7、HGF、IL-10阳性细胞数分别为155.00±32.38、69.67±10.52、100.17±16.24,较ARF组（83.17±13.67、69.67±9.18、51.83±14.03）明显增多（P﹤0.01）,而ARF组的TNF-α阳性细胞数较MSC组多（110±19.65 vs 69.67±10.52, P﹤0.01）。（4）顺铂注射7天后,免疫组化和RT-PCR方法检测到MSC组肾组织BMP-7、HGF、IL-10的蛋白和mRNA的表达均明显高于ARF组,TNF-α的蛋白和mRNA的表达则明显低于ARF组（P﹤0.01）。（5）荧光显微镜下发现GFP阳性的MSC。移植后第4天肾组织中可见绿色荧光的GFP细胞,分布在外髓质区肾小管,第7天仍可见少量荧光细胞。用megalin荧光组化方法在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光GFP细胞表达megalin蛋白。结论:MSC可改善急性肾衰竭小鼠肾功能,参与损伤肾脏的修复。其机制可能为（1）MSC在肾脏可直接分化为肾小管上皮细胞;（2）MSC促进肾脏局部生长因子的分泌;（3）MSC抑制肾脏局部炎症因子表达,增加抗炎因子表达,以减轻肾脏炎症反应。

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