胜利油田高温油藏nosZ基因编码反硝化细菌分子生态学研究

论文摘要

氮是任何生命活动不可或缺的基本元素之一。氮循环是分子态氮（Molecular nitrogen）、有机态氮（Organic nitrogen）、无机态氮（Inorganic nitrogen）等多种形态氮之间转换的生物地球化学循环过程。反硝化作用是指反硝化微生物将硝酸盐转化为气态氮或氮氧化物的过程。该过程中的亚硝酸盐还原酶基因nirS、nirK及一氧化二氮还原酶基因nosZ等被广泛地应用于反硝化微生物多样性研究。本论文运用环境微生物nosZ基因克隆文库构建和分子序列系统进化分析等分子生态学研究方法对胜利油田高温油藏中的反硝化细菌的多样性、群落结构和空间分布等进行了研究,以期揭示该极端环境中反硝化细菌的生态特点及其参与的氮元素生物地球化学循环作用。本研究建立了5个井位高温油藏采出液的反硝化细菌nosZ基因文库,共筛选了375个克隆子,翻译后的NosZ蛋白的氨基酸序列分别隶属于90个不同的分类操作单元（Operational Taxonomic Units, OTUs）,文库中少数NosZ序列与已知反硝化细菌进化关系较远,可能代表该高温油藏特异的新颖未知反硝化细菌种类或类群。分子系统学分析可将这些NosZ蛋白的氨基酸序列划分为10个簇（簇Ⅰ至簇Ⅹ）,其中除了簇X外其它簇分别属于α-变形菌纲和γ-变形菌纲两部分。大部分序列与假单胞菌目（Pseudomonadales）（簇Ⅷ）、交替单胞菌目（Alteromonadales）（簇Ⅸ）和红杆菌科（Rhodobacteraceae）（簇Ⅱ）等可培养细菌的NosZ蛋白的氨基酸序列聚集成簇,少数序列与南大西洋、大陆架沉积物和胶州湾等海洋环境的NosZ蛋白的氨基酸序列较相似。运用多元统计分析软件进行了分子生态学分析,包括针对各井位nosZ编码反硝化细菌群落结构进行的UniFrac聚类分析、PCoA （Principal Coordinates Analysis）分析以及结合了环境参数进行的典型对应分析（Canonical Correspondence Analysis, CCA）。结果表明,胜利油田高温油藏nosZ编码的反硝化菌群具有高度的多样性及复杂群落结构,同时其空间分布与环境因素具有较明显相关关系,油藏深度作为主导的环境因素可能与油藏其它理化因子（如油藏流体电导率和氧化还原电位）共同影响着该处反硝化细菌的群落结构及空间变化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 氮循环概述
• 1.1.1 氮元素存在形态
• 1.1.2 氮循环与微生物
• 1.2 反硝化微生物多样性研究
• 1.2.1 反硝化微生物参与氮循环
• 1.2.2 反硝化微生物种类
• 1.2.3 反硝化功能基因
• 1.2.4 反硝化国内外研究进展
• 1.3 油藏微生物与氮循环
• 1.3.1 微生物采油技术
• 1.3.2 油藏分子生态学研究
• 1.3.3 油藏微生物氮循环功能基因的研究
• 1.3.4 本研究的目的及意义
• 1.3.5 实验技术路线图
• 第二章 胜利油田采出液反硝化细菌nosZ基因文库的建立
• 2.1 引言
• 2.2 材料与实验方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 主要试剂（试剂盒）及溶液配制
• 2.2.3 实验仪器设备
• 2.2.4 实验方法及主要操作步骤
• 2.3 结果
• 2.3.1 胜利油田采出液宏基因组DNA提取结果
• 2.3.2 nosZ基因文库筛库PCR部分结果
• 2.3.3 nosZ基因文库RFLP酶切分析部分结果
• 2.3.4 文库丰度分析结果
• 2.3.5 多样性指数分析结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 胜利油田环境因子分析实验
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验仪器设备及分析软件
• 3.2.3 实验方法及主要操作步骤
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 油井各环境因子测试结果
• 3.3.2 油井各环境因子聚类分析结果
• 3.3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 胜利油田采出液反硝化细菌群落结构及分子生态学分析
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料和方法
• 4.2.1 分析所用软件及数据来源
• 4.2.2 NosZ蛋白的氨基酸序列系统进化树建立方法
• 4.2.3 NosZ蛋白的氨基酸序列系统进化树分析
• 4.2.4 基因文库UniFrac聚类分析及PCoA分析
• 4.2.5 典型对应分析
• 4.2.6 胜利油田油藏反硝化细菌nosZ基因分子生态学分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 NosZ蛋白的氨基酸序列系统进化树
• 4.3.2 NosZ蛋白的氨基酸序列系统进化树具体分析结果
• 4.3.3 UniFrac聚类分析与PCoA分析结果
• 4.3.4 CCA分析结果
• 4.4 讨论
• 4.4.1 油藏反硝化细菌NosZ蛋白的氨基酸序列系统进化树分析
• 4.4.2 结合环境聚类的UniFrac多元分析
• 4.4.3 CCA分析结果讨论
• 4.5 结论
• 第五章 总结
• 5.1 胜利油田采出液NosZ蛋白的氨基酸序列的系统进化分析
• 5.2 胜利油田油藏反硝化细菌群落结构与环境关系的分子生态学分析
• 5.3 探讨与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录A 攻读硕士期间发表论文目录
• 附录B 胜利油田采出液nosZ基因及氨基酸序列比对结果汇总