姜黄素对TNF-α损伤的大鼠海马神经元的保护作用及机制

论文摘要

自从1981年发现第一例艾滋病（acquired immunodeficiency syndrome,AIDS）患者至今,科学家和医学工作者针对AIDS和其病原体人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiency virus,HIV）做了大量的研究。高效抗逆转录病毒疗法（highlyactive antiretroviral therapy,HAART）的应用延长了HIV-1感染患者的生命,降低了患者的死亡率。然而当AIDS患者的死亡率下降后,AIDS患者饱受其他系统并发症困扰的问题凸显了出来,其中最常见和最严重的并发症之一是中枢神经系统并发症——艾滋病痴呆综合症（HIV-1 associated dementia,HAD）。HAD即认知、运动或行为损伤,发生于60%以上的AIDS病人中,是引起AIDS患者死亡的主要原因之一。据报道,HAD已经是60岁以下人群最常见的痴呆类型。然而HAART对HAD的治疗效果不佳,不能减轻HAD患者脑中的病变程度,患者的临床症状也未得到明显改善。令研究人员不解的是,HAD患者脑中的病毒载量很低,无法解释神经病变的严重程度。那么,如此严重的神经元损伤是如何产生的呢?根据最新的研究成果,虽然HIV-1及其蛋白gp120、gp41和反式作用因子Tat可以直接对神经元产生毒性损伤,但是这些病毒蛋白激活巨噬细胞和小胶质细胞释放的细胞因子,如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）和白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）等引起的脑组织的免疫反应和炎症损伤在HAD的病理机制中更为重要。其中TNF-α有较大神经毒性,能够刺激星形胶质细胞和小胶质细胞分泌大量兴奋性神经递质谷氨酸（glutamate,Glu）,并抑制星形胶质细胞对Glu的吸收。细胞外Glu浓度的不断升高造成神经元兴奋性中毒和损伤。中药单体姜黄素具有抗炎、抗HIV、抗肿瘤等多重药理活性,姜黄素可直接或间接影响HIV-1长末端重复序列,抑制HIV-1复制所需的蛋白酶和整合酶,干扰病毒复制。姜黄素还可以抑制TNF-α、IL-1β和IL-8等炎症因子,减轻炎性疾病的症状。然而将姜黄素运用于HAD的防治国內外尚未见报道。本室以往的研究已证明姜黄素可以改善gp120所致学习记忆障碍大鼠的行为学功能,提高学习记忆能力。本实验在此基础上从抗炎角度着重研究了姜黄素对炎症因子TNF-α损伤的大鼠海马神经元的保护作用及机制,旨在为防治HAD提供有益的实验依据。目的观察中药单体姜黄素对TNF-α损伤的大鼠海马神经元的结构性和功能性保护作用,并初步探讨姜黄素对TNF-α损伤的大鼠海马神经元的结构及功能保护作用的机制,为姜黄素应用于临床防治HAD提供重要的实验依据。方法1.大鼠海马原代细胞培养共使用新生24小时的SprautNe-Dawley（SD）大鼠30只。将大鼠海马神经元分离培养至第7天,用免疫组化荧光染色的方法标记神经元中的Tau蛋白,在倒置荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察其形态特征,鉴定神经元。2.经过鉴定的神经元分别与低、中、高浓度的TNF-α及低、中、高浓度的姜黄素共同孵育。通过观察神经元形态学变化筛选出TNF-α的损伤浓度（高浓度,100ng/mL）及姜黄素的安全浓度（低浓度,1μmol/L）。3.海马神经元培养至第5天后分为4组:对照组、TNF-α组、姜黄素组和姜黄素+TNF-α组。对照组培养基中不加药物。TNF-α组培养基中含有100 ng/mL的TNF-α。姜黄素培养基中含有1μmol/L的姜黄素。姜黄素+TNF-α组培养基中则同时含有1μmol/L的姜黄素和100 ng/mL的TNF-α。各组药物处理后立刻在倒置显微镜下进行1小时动态延时摄片,48小时后再进行静态摄片观察神经元生长状况和形态变化。另一批分组相同的海马神经元培养至第7天时再向培养基中加入各组相应药物,加药后立即用激光共聚焦显微镜观察各组药物处理后神经元内荧光标记的Ca2+浓度变化。4.采用随机数字表法将50只SD大鼠平均分为10组:对照组、TNF-α基线组、N-甲基-D-天（门）冬氨酸（NMDA）基线组、姜黄素基线组、TNF-α组、TNF-α失活组、NMDA组、姜黄素组、姜黄素+TNF-α组、姜黄素+MNDA组。制备大鼠海马脑片,将脑片孵育在通有混合氧（95%O2,5%CO2）的人工脑脊液（artificialcerebrospinal fluid,ACSF）中至少1小时。然后各组根据要求在ACSF中加入相应浓度的药物再孵育脑片30分钟。采用细胞外电生理技术记录大鼠海马脑片CA1区锥体细胞层的兴奋性突触后电位（EPSP）,计算各组EPSP起始斜率的变化情况,观察各组海马CA1区长时程增强（long term-potentiation,LTP）的变化情况。TNF-α基线组、NMDA基线组和姜黄素基线组仅给予海马脑片基础刺激,不进行高频电刺激（high frequency stimulation,HFS）。各组ACSF所含药物及浓度如下:对照组不含药物;TNF-α基线组、TNF-α组终浓度为4.5ng/mL;TNF-α失活组先将TNF-α70℃水浴30分钟失活后再加入ACSF,终浓度为4.5ng/mL;NMDA基线组、NMDA组终浓度为0.5mmol/L;姜黄素基线组、姜黄素组含1μmol/L姜黄素;姜黄素+TNF-α组同时含有1μmol/L姜黄素和4.5ng/mL的TNF-α;姜黄素+MNDA组同时含有1μmol/L姜黄素和0.5mmol/L的NMDA。结果1.经过荧光染剂Cy3标记后的Tau蛋白把神经元胞体和突起的形态清晰的表现出来。神经元胞体呈锥体形或椭圆形,胞体生长出一条较为粗大的轴突和若干树突。轴突和树突逐渐分支出很多次级突起,多个神经元聚集在一起,突起相互交错形成网状。2.低浓度（1μmol/L）的姜黄素不会对神经元的形态和生长产生明显影响,中浓度（10μmol/L）和高浓度（20μmol/L）的姜黄素则会抑制神经元的生长发育,当姜黄素的浓度为20μmol/L时,神经元出现死亡。TNF-α的浓度达到100ng/mL时会明显抑制神经元的生长发育;神经元胞体较小,呈梭形,光晕不明显;突起很少,轴突和树突未生长出次级突起;神经元生长稀疏,相互之间突起没有形成网状结构。3.加药1小时后对照组和姜黄素组的神经元胞体正常,轴突、树突以及次级分支生长正常;TNF-α组的神经元胞体出现肿胀,轴突、树突缩短,次级分支逐渐消失;而姜黄素+TNF-α组的神经元胞体恢复正常,轴突、树突以及次级分支生长亦恢复正常。48小时后镜下可见对照组和姜黄素组的神经元生长密集、胞体较大、胞体丰满,突触及分支多,可见2、3级分支,并形成网状结构;TNF-α组神经元生长稀疏,胞体较小,突触少,没有2级3级分支,没有形成网状结构;而姜黄素+TNF-α组的神经元胞体及轴交情况恢复正常。4.激光共聚焦扫描显示TNF-α可以引起神经元胞内Ca2+浓度的迅速升高,荧光强度增加,而姜黄素可以部分拮抗TNF-α引起的神经元胞内Ca2+浓度升高（P＜0.05 vs TNF-αgroup）,维持神经元细胞内的Ca2+稳态。5.电生理实验中用高频电刺激（HFS,100Hz,1000ms x 2,间隔20s）Schaffer侧支轴突,在海马CA1区记录长时程增强（LTP）。结果观察到TNF-α可以对大鼠海马脑片的LTP产生明显的抑制作用,EPSP起始斜率下降（P＜0.05 vs controlgroup）。而失活的TNF-α对LTP不产生抑制作用。NMDA受体特异性激活剂NMDA也对大鼠海马脑片LTP产生明显的抑制作用,EPSP起始斜率下降（P＜0.05 vscontrol group）。而姜黄素可以拮抗TNF-α和NMDA对海马脑片LTP的抑制作用,EPSP起始斜率恢复正常（P＜0.05 vs TNF-αgroup;P＜0.05 vs NMDA group）,而TNF-α、NMDA和姜黄素对基础EPSP并无影响（P＞0.05 vs control group）。结论1.低浓度的姜黄素可以保护大鼠海马神经元不受炎症因子TNF-α的损伤,预处理姜黄素后神经元形态正常,生长发育良好。姜黄素对海马神经元具有结构性保护作用。2.姜黄素可以拮抗TNF-α和NMDA引起的大鼠海马神经元LTP抑制,维持LTP的稳定。姜黄素对海马神经元具有功能性保护作用。3.姜黄素对海马神经元的结构性和功能性保护作用的机制是姜黄素通过作用于神经元细胞膜上的NMDA受体拮抗TNF-α引起的神经元细胞内Ca2+浓度升高,维持神经元细胞内的Ca2+稳态,从而起到保护作用。综上所述,低浓度的姜黄素可以拮抗炎症因子TNF-α所致的神经元损伤,可以通过作用于神经元细胞膜上的NMDA受体减少Ca2+内流,维持神经元细胞内的Ca2+稳态,对神经元产生结构性和功能性保护作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 前言
• 1 HAD发病机制的研究进展
• 1.1 艾滋痴呆综合症概述
• 1.2 HIV-1进入中枢神经系统的途径和机制
• 1.3 HIV-1感染中枢神经系统后的生物学特性
• 1.4 HIV-1病毒来源的神经损伤
• 1.5 免疫反应对神经元的损伤
• 2 TNF-α在HAD中的作用及机制
• 3 目前防治HAD的研究进展
• 4 姜黄素药理作用研究进展
• 4.1 抗炎作用
• 4.2 抗HIV-1作用
• 4.3 抗肿瘤作用
• 4.4 其他作用
• 2+在神经元中的作用'>5 Ca²⁺在神经元中的作用
• 2+与长时程增强'>5.1 Ca²⁺与长时程增强
• 2+与神经元的生长发育'>5.2 Ca²⁺与神经元的生长发育
• 6 本研究的目的和意义
• 第一部分 大鼠海马神经元的培养和鉴定
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要仪器与试剂
• 1.3 主要溶液的配制
• 2 实验方法
• 2.1 大鼠海马神经元的分离和培养
• 2.2 大鼠海马神经元的免疫组化荧光染色
• 2.3 显微镜观察大鼠海马神经元的形态特征
• 3 结果
• 3.1 突起分级标准
• 3.2 倒置荧光显微镜观察大鼠海马神经元
• 3.3 激光共聚焦显微镜普通光观察大鼠海马神经元
• 第二部分 TNF-α和姜黄素的剂量筛选
• 1 实验材料
• 1.1 主要仪器与试剂
• 1.2 主要溶液的配制
• 2 实验方法
• 2.1 大鼠海马神经元的分离和培养
• 2.2 细胞分组
• 2.3 倒置显微镜普通光观察大鼠海马神经元
• 3 结果
• 第三部分 姜黄素对TNF-α损伤的大鼠海马神经元的结构性保护及机制
• 1 实验材料
• 1.1 主要仪器与试剂
• 1.2 主要溶液的配制
• 2 实验方法
• 2.1 大鼠海马神经元的分离和培养
• 2.2 倒置显微镜普通光观察大鼠海马神经元
• 2+浓度变化'>2.3 激光共聚焦显微镜观察大鼠海马神经元胞内Ca²⁺浓度变化
• 3 结果
• 3.1 加药后1小时神经元形态变化和生长情况
• 3.2 加药后48小时神经元形态变化和生长情况
• 2+浓度变化'>3.3 大鼠海马神经元胞内Ca²⁺浓度变化
• 第四部分 姜黄素对TNF-α损伤的大鼠海马神经元的功能性保护及机制
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要仪器与试剂
• 1.3 试剂配置
• 2 实验方法
• 2.1 实验分组
• 2.2 大鼠海马脑片CAI区LTP的记录
• 3 统计学方法
• 4 结果
• 讨论
• 1 姜黄素药理作用的剂量依赖性
• 2 姜黄素对大鼠海马神经元的保护作用
• 2.1 姜黄素抗HIV-1的药效研究
• 2.2 姜黄素对TNF-α损伤的大鼠海马神经元的保护作用
• 3 姜黄素的神经保护作用机制
• 结论
• 参考文献
• 缩略词表
• 在读期间发表论文
• 致谢
• 附图