论文摘要
卵巢癌是妇科肿瘤中致死率最高的恶性肿瘤,其5年生存率仅为30%。卵巢癌患者在被确诊时大部分已进入晚期。缺乏早期的诊断和治疗手段使得卵巢癌成为医生和医学科学研究者们面临的一个科学难题之一。目前的靶向基因治疗也许对这一难题的解决有所帮助。本课题使用针对CXCL1基因的RNA干扰体系作为治疗基因,并使用具有主动靶向性的基因递送载体来提高基因药物的递送效率,为卵巢癌的治疗提供一个新思路。在第一部分,我们检测了CXCL1基因在卵巢癌细胞系ES-2和SKOV-3中的表达利用RTPCR和ELISA方法筛选了能够有效下调CXCL1基因的siRNA序列,结果表明,CXCL1基因在E5-2及SKOV-3细胞中均有较强表达,siRNA对CXCLlmRNA与蛋白的表达有沉默效果,序列5’-GCUGGCGGAUCCAAGCAAA-3’的沉默效果明显,抑制率为57.2%和51.3%。在第二部分,我们利用筛选出的siRNA序列构建了具有GFP报告基因的质粒,并通过测序证实靶序列成功克隆到质粒中。接下来,我们通过观察GFP的表达检测该体系在ES-2细胞中的转染效率,并使用半定量PCR检测其对CXCL1基因的沉默效果。实验结果显示构建的RNA干扰质粒的转染效率为61.2%,对CXCL1基因mRNA表达的抑制率为54.1%。为了使上述构建的RNA干扰质粒高效地、选择性地进入卵巢癌细胞系（ES-2）发挥作用。在本研究的第三部分,我们制备了一个针对质粒DNA的载体系统。该系统使用卵泡刺激素（FSH）多肽修饰接枝了聚乙二醇（PEG）的聚乙烯亚胺（PEI）为基础的基因递送系统。卵泡刺激素多肽能够特异地与ES-2细胞表面的卵泡刺激素受体（FSHR）结合,我们可以利用这个特性改进转导效果。首先我们使用具有双功能基团的聚乙二醇衍生物（MAL-PEG-NHS）,NHS一端专属地与卵泡刺激素多肽上的氨基结合,而MAL则完全与PEG上氨基结合。由于以PEI为基础的核酸递送系统具有比较高的细胞毒性,而且在高浓度DNA递送时会产生沉淀。因此,我们接枝了0.5%、1%和2%的卵泡刺激素多肽修饰的聚乙二醇（F-PEG-MAL）到聚乙烯亚胺上去,形成0.5%、1%和2%的卵泡刺激素修饰的聚乙二醇聚乙烯亚胺递送系统（F-PEG-PEI）。该体系与质粒DNA在不同的氮磷（N/P）比下形成各种纳米级的复合物。我们通过粒径测试、电位测试、凝胶电泳阻滞实验、包封率测试、细胞毒性测试和转染效率测试寻找最佳配比的复合物。结果表明,比例为2%、氮磷比为25的经卵泡刺激素多肽修饰的纳米复合物（F-NP）具有比较适合的粒径和电位,100%的包封率,毒性较低和68.9%的转染效率。我们使用RT PCR和ELISA的方法考察该RNA干扰体系对CXCL1基因的沉默效果,发现其对mRNA表达和蛋白表达的抑制率分别为59.1%和52.7%。在本研究的最后部分,我们采用CCK8细胞增殖检测、细胞迁移检测和细胞侵袭检测考察了经卵泡刺激素多肽修饰的纳米复合物对肿瘤细胞的生物学影响。我们发现对CXCL1基因的沉默可以抑制卵巢癌细胞系ES-2的增殖、迁移和侵袭,表明CXCL1基因在卵巢的发生、发展和转移中可能起着至关重要的作用。经卵泡刺激素多肽修饰的纳米复合物对ES-2细胞增殖的抑制效果更为显著,抑制率为37.9%（96h）,与未经配体修饰的系统相比有极显著差异（P<0.01）。在细胞迁移和细胞侵袭实验中,经卵泡刺激素多肽修饰的纳米复合物与未经配体修饰的系统相比,能够显著抑制细胞的迁移和侵袭（P<0.01）。本研究制备的经卵泡刺激素多肽修饰的纳米复合物能够有效的递送RNA干扰药物进入卵泡刺激素受体表达阳性的细胞,并沉默靶基因、抑制肿瘤细胞的生长、迁移及侵袭。我们的研究结果提示该RNA干扰递送系统,不仅利用了受体主动靶向治疗的优势,而且通过优化纳米复合物中PEG的接枝量及N/P比,大大提高了对卵巢癌细胞的特异性杀伤效果,并且改善了以基于PEI作为核酸递送载体的RNA干扰系统的生物相容性。该研究为靶向治疗卵巢癌提供了一个新型的实验工具。
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