缝隙连接改造剂ZP123对室颤模型心肌缝隙连接蛋白Cx43的影响研究

论文摘要

研究背景：心室颤动（室颤）是心脏性猝死最常见的原因,约占所有心脏骤停的75%。室颤时心室收缩失去了规则性,心室肌快速、不同步收缩,心脏的电及机械活动严重紊乱。室颤的发生发展与缝隙连接的电重构和结构重构存在一定关系。Cx43是构成心室肌细胞间的缝隙连接的亚单位,其表达与分布的平衡对缝隙连接功能的正常发挥起重要作用。ZP123是一种新型的抗心律失常肽,能够增加缝隙连接之间的电耦联及冲动传导。目的：观察室颤发生后进行心肺复苏缝隙连接蛋白Cx43表达水平的改变以及缝隙连接改造剂ZP123对Cx43表达的影响。方法：1.实验动物：随机选取家猪30只,雌雄不限,体重33.5-38kg。2.室颤模型制作：3%戊巴比妥钠（30mg/kg）耳缘静脉静注麻醉,气管插管,连接呼吸机,在SIMV模式下调整呼吸机参数为：潮气量10—15ml/kg体重,呼吸频率16—20次／分,吸入氧浓度（FiO250%—80%）,吸气与呼气时间比为1：1.5—2.0,呼气末正压为5cmH2O （0.49Kpa）。用体外自动除颤器监测心电图及血氧饱和度（Sa02）,分别测量基础状态及达到ROSC后的R-R间期、QT间期,用Bazett’s公式计算出校正的QT间期（QTc）。穿刺股动静脉,分别将压力导管送入主动脉和右心房,在X线下确定导线位置,并连于多导电生理记录仪,监测与记录主动脉压力和右房压力,冠脉灌注压（CPP）为主动脉舒张压减右心房舒张压。药物应用：动物随机分为3组,每组10只,ZP123组：ZP123 1μg/kg静推+10μg·kg-1·h-1溶于50ml微量泵泵入15分钟；对照组：生理盐水50ml微量泵泵入15分钟；假手术组：只麻醉取心肌,不予致颤。致颤：将体外电刺激器火线端与零线端的导电针头分别插入心前区左上方与右下方的皮下,以80V持续刺激5S可以成功的诱发持续室颤。室颤成功的标准：（1）心电图示室颤波形；（2）主动脉压力失去波动,降至10-20mmHg以下。3.心肺复苏：室颤模型一旦成功建立,即撤除呼吸机,待室颤持续8min后,立即开始胸外心脏按压,同时接气囊,按压通气比为30：2,5个复苏周期即2分钟后,进行脉搏与心率评估,仍为室颤的给予电除颤,能量为70J（双相）,然后立即开始基本CPR,待5个复苏周期后进行脉搏与心率评估,如此循环。对于30分钟内未达到自主循环恢复（主动脉收缩压>80mmHg至少持续lmin）的动物放弃。达到自主循环恢复的动物立即高级生命支持,并观察1小时。存活时间达到一小时的动物用氯化钾处死,迅速开胸沿左心室长轴,留取0.5cm3大小的左心室游离壁心肌组织数块,一部分用4%多聚甲醛固定,用于免疫荧光分析,另一部分放入液氮中速冻,然后转存至-80℃冰箱冻存,用于Western-Blot分析。4.免疫荧光及激光共聚焦显微镜：4%多聚甲醛固定心室肌组织24小时,石蜡包埋后于切片机上切成4μm厚的组织切片,石蜡切片脱蜡至水,枸橼酸盐缓冲液微波修复抗原15min,5%正常山羊血清封闭20分钟,滴加1：100稀释的Cx43多克隆抗体4℃过夜,滴加1：500稀释的IgG-FITC二抗,37℃孵育30分钟,缓冲甘油封片。以德国Leica公司TCS SP2型激光扫描共聚焦显微镜观察,取488nm波长蓝光激发FITC,发生光为519nm绿光。每张切片至少取四个视野,逐层扫描获取图像。将获取的厚图像去除背景,留下真正的荧光染色部分以供分析。用Image-Pro Plus 6.0软件分析荧光强度,计算当前视野下Cx43面积百分比及积分光密度。5. Western-Blot分析：提取蛋白后上样,进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后,将目的蛋白转至PVDF膜上。转膜后将PVDF膜放入5%脱脂奶粉（TBST）稀释室温封闭2小时,滴加1：500稀释的Cx43多克隆抗体4℃过夜,滴加二抗（1：10000）室温孵育2小时,用增强化学发光法显色,X光片曝光显影,凝胶成像分析系统Quantity One摄像分析,测定目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度值,二者的比值作为Cx43的表达水平进行比较。6.电镜观察取1mm3心肌组织数块,固定,包埋,切片,染色,在透射电子显微镜下,观察心肌细胞超微结构变化并照相。详细观察闰盘结构和GJ。7.统计学分析：所有数据以均数x±s表示,应用SPSS16.0统计软件进行统计分析,采用单因素方差分析（one-way ANOVA）, P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.三组动物基础状态无统计学差异；心肺复苏30min后,ZP123组和对照组动物的血流动力学参数及QTc无统计学差异。ZP123组有6只动物达自主循环恢复并存活1小时,对照组有5只动物达自主循环恢复并存活1小时。ZP123组动物的除颤能量明显低于对照组,差异有统计学意义（325±130 J vs.485±149 J,P<0.05）。2.免疫荧光结果：假手术组Cx43荧光信号强,形态清晰,分布均匀,排列有序；对照组Cx43荧光信号弱,形态模糊,排列紊乱,呈现不均一分布；ZP123干预组Cx43的荧光信号较强,形态相对清晰,不均一分布的程度较对照组减轻。图象定量分析显示Cx43荧光信号的面积百分比以及积分光密度值对照组明显低于假手术组,差异有统计学意义（1.01±0.07 vs.1.46±0.06：18800±1772 vs.29600±2160,P<0.05）,而ZP123组的Cx43荧光信号的面积百分比以及积分光密度值明显高于对照组,差异有统计学意义（1.32±0.05vs.1.01±0.07；27200±1930 vs.18800±1772,P<0.05）。3. Western-Blot结果：图像定量分析显示,对照组Cx43表达（0.75±0.07）较假手术组（1.07±0.04）及ZP123组（0.95±0.06）明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）。4.电镜结果：透射电子显微镜（×7,500）显示ZP123组动物的心肌纤维相对增粗、分布不均匀。晶体较少降解,线粒体形态几乎正常,闰盘结构相对完整。透射电子显微镜（×7,500）显示对照组动物的心肌纤维增粗分布不均匀,线粒体肿胀,晶体不完整。闰盘失去连续性,散乱的分布于心肌。透射电子显微镜（×7,500）显示假手术组动物的心肌线粒体形态、结构正常,心肌纤维排列整齐。闰盘连续的位于两个相邻心肌之间。结论：1.随着室颤的发生发展,心肌组织闰盘变得不连续,Cx43表达减少,排列紊乱,呈不均一分布；2.ZP123可减少或逆转Cx43的降解,并且使其分布趋于均一；3.ZP123可以降低除颤能量,从而减少对心肌的损伤。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附表
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况