猪圆环病毒2型ORF2的序列分析及在昆虫细胞中的表达

论文摘要

猪圆环病毒是圆环病毒科,圆环病毒属的成员。根据其致病力和基因组的特点可分为PCV1和PCV2两种血清型,其中PCV1无致病性,主要存在与猪体及猪源细胞系内;PCV2对猪具有致病性,是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症的病原之一。PCV2基因组含有两个主要的开放阅读框,其中ORF2基因编码病毒的衣壳蛋白,是主要的结构蛋白,具有较好的免疫原性。尽管两个血清型ORF2之间氨基酸同源性为68%,但它们刺激机体产生的血清抗体之间不存在交叉反应,因此ORF2蛋白在研究猪圆环病毒血清抗体鉴别诊断与基因工程疫苗方面具有重要意义。1.根据GenBank中猪2型圆环病毒的核酸序列,设计1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的死亡仔猪组织病料中扩增出ORF2基因,将其克隆到pMD18-T载体上,筛选获得重组质粒pMD18-ORF2。氨基酸序列测定分析表明,克隆ORF2与已经公布的PCV2 ORF2分离株的同源性在91.5%-99.4%,其中与黑龙江的同源性仅为91.5%,与杭州分离株的同源性达到99.4%,表明我国各地区之间PCV2的分离株存在一定的差异。2.通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将圆环病毒2型的ORF2全基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTMHT B中,获得重组转移载体pFast-OFR2 ,再将其转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,发生转座作用,经蓝白菌落筛选得到含ORF2基因的重组穿梭载体Bac. ORF2 ,以脂质体介导的方法将重组穿梭载体转染sf9细胞,获得重组病毒,命名为Ac. ORF2。间接免疫荧光分析表明,PCV2阳性血清能使Ac. ORF2感染的sf9昆虫细胞呈强的荧光着色;SDS-PAGE与Western blotting分析可见大小约为28kD的特异性带,表明Ac. ORF2在sf9细胞中成功表达了PCV2 ORF2蛋白。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1 圆环病毒的研究进展
• 1.1 猪圆环病毒的发现和命名
• 1.2 PCV 的病原学
• 1.3 PCV 的分子生物学特性
• 1.4 流行病学
• 1.6 临床症状和病理变化
• 1.7 致病机理
• 1.8 诊断方法
• 1.9 防治
• 2 杆状病毒表达系统
• 2.1 杆状病毒的特性
• 2.2 杆状病毒的重组方式
• 2.3 杆状病毒表达系统的优点
• 第二部分 研究报告
• 第一章 两株圆环病毒2 型ORF2 的克隆及其序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 病料
• 1.2 酶和试剂
• 1.3 引物
• 1.4 模板的制备
• 1.5 ORF2 基因的扩增
• 2 试验结果
• 2.1 ORF2 基因PCR 扩增
• 2.2 重组质粒的鉴定
• 3 讨论
• 第二章 猪圆环病毒2 型ORF2 在昆虫细胞中的表达
• 1 材料和方法
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器设备
• 1.3 细胞和病毒
• 1.4 目的基因的获得
• 1.5 重组转座载体的构建
• 1.6 重组杆状病毒穿梭载体的构建
• 1.7 重组杆状病毒穿梭载体Bac-ORF2 转染sf9 昆虫细胞
• 1.8 目的蛋白的表达及检测
• 2 试验结果
• 2.1 酶切鉴定
• 2.2 序列分析
• 2.3 重组杆状病毒穿梭载体的PCR 鉴定
• 2.4 sf9 细胞的转染与病变
• 2.5 重组杆状病毒的鉴定
• 2.6 目的蛋白的表达与鉴定
• 3 讨论
• 第三章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介