冻融法制备水溶性壳聚糖中低温脱乙酰与高温热分解的机理及动力学

论文摘要

壳聚糖作为自然界唯一的碱性多糖，因其良好的生物相容性、广谱抗菌性、生物可降解性、重金属螯合性、成膜成纤性等特殊功能，引起了广泛关注。由于其只能溶于某些特殊酸性溶液，部分结构和功能实际由壳聚糖盐体现，这对壳聚糖的理论和应用研究的深入十分不利。制备较高分子质量、非衍生化的、真正意义上的水溶性壳聚糖（Water-Soluble Chitosan，WSC），对相关基础研究和应用研究意义重大。本研究采用碱液冻融循环处理甲壳素，并结合均相脱乙酰反应，不引入任何基团，制备了1种脱乙酰度（Degree of Deacetylation，DDA）约50％，分子量约30万，pH 12以下冷水可溶的WSC，突破了传统制备方法耗时长、收率低、成本高、降解严重、水溶性差的缺陷。通过低温脱乙酰动力学研究、采用XRD、FT-IR、Raman、DSC、CD和AFM等考察冻融对甲壳素结构的影响，从而发展冻融循环处理为1种简便、可控、绿色、高效的甲壳素前处理手段，并初步揭示了WSC的形成机理。为合理利用WSC，本研究考察了其热稳定性和安全性，并采用多重扫描速率热分析法、FT-IR及MTT实验等，揭示了WSC的热分解机理、热分解动力学及细胞毒性等。主要研究结果如下：1．慢速冷冻过程中冰晶的形成和生长可破坏甲壳素分子间氢键作用，降低分子结构规整性，破坏凝聚态结构并使其结晶度下降。但单纯冷冻导致的结构破坏和结晶度降低的程度较小，不足以使甲壳素形成完全均相溶液，且这种结晶破坏作用部分可逆，经加热处理后又会形成新的结晶结构。慢速冷冻——低温解冻的冻融循环处理过程中冰晶的反复形成和重结晶能够更彻底的破坏甲壳素凝聚态特别是晶态结构，-18℃下冻融3次，可使甲壳素在NaOH溶液中完全溶解，获得甲壳素终浓度约为4wt％，NaOH终浓度约为10．67wt％的均相溶液，25℃经过48h-72h静置，可制备几乎全溶的WSC。2．低温脱乙酰动力学研究结果表明，碱液浓度、反应时间、解冻方式及其交互作用均显著影响脱乙酰进程。乙酰氨基含量与反应时间在半对数坐标轴上线性相关（R2>0．9000），低温非均相下脱乙酰反应符合准一级反应动力学方程，表观速率常数3．3-22．8×10-3h-1；35wt％NaOH，-5℃-35℃下的表观反应活化能为9．76 kJ／mol，低于常温及高温反应活化能，表明冷冻特别是冻融循环可促进反应进行。3．XRD结果表明，冻融循环处理能显著降低甲壳素分子内和分子间强氢键相互作用，破坏甲壳素分子致密的晶体结构，导致其水溶成为可能。FT-IR分析结果表明，水溶性样品或近似水溶的样品，3448cm-1处-OH的振动吸收峰明显移向低波数区域，且水溶性越好偏移量越大，该区域面积越小；代表分子内／分子间氢键相互作用的3265和3103cm-1处的吸收峰，在水溶性样品上已经观测不到。DSC研究结果表明，DSC的峰面积、峰高等参数不但与DDA有关，更受水溶性即结晶性的影响，甚至某些时候结晶度的影响要远超DDA的影响。CD研究结果也表明，冻融循环和均相脱乙酰打破了分子间强氢键相互作用，使WSC的空间结构更为舒展，较少呈现螺旋结构，更易溶于水中。AFM结果表明，WSC在水溶液中以中性，而不是以质子化形式存在，说明本研究制备的是1种自然状态下的壳聚糖而非其衍生物。4．DDA一定时，WSC水溶液在208nm-212nm的吸光度A与波长λ呈线性关系，其斜率与对应溶液的浓度呈线性关系，初步建立了1种用紫外多波长回归测定WSC水溶性的新方法，从而克服了传统的滤纸称重法繁琐、准确度不高的缺点。5．热分解产物FT-IR结果研究表明，壳聚糖、甲壳素和WSC的热降解是高分子主链的无规解聚，降解最先发生在键能较弱的C-O-C上，其中WSC的热分解起始位垒更高，分解过程中伴随更多复杂反应。壳聚糖盐酸盐（Chitosan Hydrochloride，CHC）的热分解是典型的多步反应，先是高分子铵盐的分解，后为高分子主链的解聚。6．多重扫描速率法研究了壳聚糖、甲壳素、WSC和CHC的热分解反应动力学，4种物质的反应活化能E和指前因子lnA值分别为153．02±2．67、162．96±5．47、188．20±1．98、169．40±1．52(1st stage)、126．52±1．62 kJ／mol(2ndstage)和23．46±1．47、23．09±1．14、37．82±1．12、35．28±0．62(1st stage)、24．69±0．44 min-1(2ndstage)。Achar法判定了4种物质热分解的最概然机理函数。壳聚糖为f（α）=3／2（1-α）2/3[1-（1-α）1/3]-1，属三维扩散、球形对称机理；甲壳素为f（α）=3／2（1-α）4／3[1，（1-α）1／3-1]-1，属三维扩散机理：WSC为f（α）=2（1-α）3/2，属2／3级化学反应；CHC 2个分解阶段最概然机理函数相同，均为f（α）=1-α，属每个颗粒上只有1个核心的随机成核和随后生长机理。7．WSC细胞毒性研究结果显示，WSC无细胞毒性，未质子化的氨基对L929细胞具有一定保护作用。动态凝血实验结果初步显示，WSC醋酸溶液具有一定凝血作用，但其水溶液无凝血作用。

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摘要

Abstract

第一章前言

1 甲壳素/壳聚糖的结构及基本理化性质

2 水溶性甲壳素/壳聚糖的制备研究进展

2.1 控制脱乙酰度

2.2 壳聚糖的化学修饰

2.3 壳聚糖的降解

3 水溶性甲壳素/壳聚糖的应用研究进展

3.1 低分子量壳聚糖/壳寡糖的应用研究进展

3.2 水溶性壳聚糖衍生物的应用研究进展

3.3 半脱乙酰水溶性壳聚糖的应用研究进展

4 本课题研究目的及意义

第二章冷冻对甲壳素结构的影响及低温脱乙酰动力学研究

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验仪器

2.2 甲壳素-碱溶液冻融循环处理

2.3 结构表征

2.3.1 粉末X射线衍射（XRD）

2.3.2 傅立叶变换红外光谱（FT-IR）

2.3.3 差示扫描量热（DSC）

2.4 低温脱乙酰动力学研究

2.4.1 动力学数据处理

2.4.2 脱乙酰度（DDA）的测定

3 结果与分析

3.1 冷冻处理对甲壳素结构的影响

3.1.1 甲壳素低温非均相碱脱乙酰反应

3.1.2 冷冻对甲壳素固体结构的影响

3.1.3 最优化脱乙酰反应条件

3.2 低温脱乙酰动力学研究

3.2.1 NaOH浓度对脱乙酰反应的影响

3.2.2 冷冻处理温度对脱乙酰反应的影响

3.2.3 解冻方式对脱乙酰反应的影响

4 本章小结

第三章水溶性壳聚糖的制备及结构表征

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验仪器

2.2 WSC的制备

2.2.1 循环冻融法处理甲壳素

2.2.2 WSC的制备

2.3 WSC基本性质测定

2.3.1 脱乙酰度（DDA）测定

2.3.2 水溶性（WS）测定

2.3.3 溶解稳定性评价

2.3.4 粘均分子量（Mη）测定

2.4 WSC的紫外光谱研究

2.4.1 溶剂的影响

2.4.2 时间的影响

2.4.3 DDA的影响

2.5 WSC结构表征

2.5.1 粉末X射线衍射（XRD）

2.5.2 傅立叶变换红外光谱（FT-IR）和拉曼光谱（Raman）

2.5.3 差示扫描量热（DSC）

2.5.4 圆二色谱（CD）

2.5.5 原子力显微镜（AFM）

3 结果与分析

3.1 甲壳素均相溶液的制备

3.2 WSC的制备

3.2.1 脱乙酰度和水溶性

3.2.2 溶解稳定性评价

3.2.3 粘均分子量

3.3 WSC的紫外光谱研究

3.4 结构表征

3.4.1 XRD分析

3.4.2 FT-IR和Raman光谱分析

3.4.3 DSC分析

3.4.4 CD分析

3.4.5 AFM分析

4 本章小结

第四章水溶性壳聚糖热分解动力学研究

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验仪器

2.2 壳聚糖热分解动力学研究

2.2.1 多重扫描速率非等温DSC

2.2.2 热解产物FT-IR红外光谱

3 结果与分析

3.1 水溶性壳聚糖热分析结果

3.2 水溶性壳聚糖热分解动力学研究

3.2.1 热分解动力学的数据处理方法

3.2.2 热分解动力学参数的获得

3.2.3 最可机理函数的判定

3.3 水溶性壳聚糖的热分解FT-IR光谱

4 本章小结

第五章水溶性壳聚糖初步生物学评价

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验仪器

2.2 细胞毒性研究

2.2.1 培养液的配制

2.2.2 配制PBS缓冲溶液

2.2.3 MTT试剂的配制

2.2.4 配制材料浸提液

2.2.5 MTT法测定细胞毒性

2.2.6 细胞毒性评价方法

2.2.7 L929细胞形态学观察

2.3 动态凝血实验

3 结果与分析

3.1 细胞毒性

3.2 动态凝血实验

4 讨论

第六章结论与展望

1 结论

2 研究特色

3 展望

参考文献

致谢

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