母鼠孕前慢性应激和氟西汀治疗对母鼠及其子代行为学和神经生物学的影响

论文摘要

背景和目的:母代应激或抑郁对子代行为有消极的影响,并与子代情感障碍的高危险性相关。对抑郁组和非抑郁组母代所产子代进行随访追踪调查表明:母代抑郁对子代的严重抑郁性障碍、焦虑障碍都是一个比较强而持续的危险因子,并且抑郁父母所产子代的物质依赖性是非抑郁父母所产子代的3倍多。目前国内外对于孕期应激的研究比较多见,孕期的精神社会应激会显著增高患者的CRH和皮质醇水平,造成不良妊娠结局,如早产、低体重儿、妊娠期高血压等。许多动物实验表明孕期应激与子代增多的抑郁样行为和焦虑样行为有关,而且孕期应激与产后抑郁发生关系密切,对后代的心理、行为、中枢系统发育都有不利影响。然而,对母代孕前抑郁对子代的影响和相关的神经生物学机制在动物模型上的研究还较少。氟西汀是一种选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）,被广泛应用于抑郁症和焦虑症的治疗,通过抑制突触前膜细胞对5-羟色胺的再摄取来增加细胞外神经递质的浓度。本课题通过母鼠孕前慢性应激抑郁模型和氟西汀治疗,观察母鼠及其子代行为学和海马DCX表达的变化,旨在探讨孕前慢性应激对母鼠及其子代行为学和神经生物学的影响。材料和方法:从汕头大学医学院实验动物中心（汕头,中国）取2月龄性成熟期的雌性Sprague dawley（SD）大鼠,体重约180～220g,适应性饲养一周,室温保持在22±1℃,自然光照,自由进食、进水。行开场试验,根据开场试验结果把24只SD大鼠分为4组,每组6只,即:孕前慢性应激+氟西汀注射组（cus+Flu组）、孕前慢性应激+溶剂注射组（cus+Ns组）、非应激+氟西汀注射组（con+ Flu组）、非应激+溶剂注射组（con+ Ns组）。非应激+氟西汀注射组和非应激+溶剂注射组大鼠除了每日分别给予氟西汀和溶剂腹腔注射外,单笼饲养;孕前慢性应激+氟西汀注射组和孕前慢性应激+溶剂注射组,按21d慢性不可预见性应激方案执行,为了保证应激的不可预测性,应激的种类随机安排并且最后是禁食、禁水,采用孤养,1只大鼠/笼。每天上午8点左右腹腔注射完氟西汀和溶剂生理盐水0.5小时后按21d慢性不可预见性应激方案执行。大鼠生产繁殖和子代饲养:慢性应激后16d（为了去除或减少氟西汀及其活性代谢产物去甲氟西汀对妊娠或胎儿的影响）,采用1雄多雌（雄:雌比例为1:4）间隔同居法繁殖,于8:00pm合笼进行交配,次日7:00am～8:00am做雌鼠阴道涂片,以显微镜下查看到精栓记为妊娠第1d,单笼喂养。子鼠出生后由其母喂养,出生后22 d断奶,分别用1m和2m龄的子鼠进行行为学实验,每组的1m和2m龄子鼠分别从每组母鼠所产子代中各取1只雄鼠、1只雌鼠,其中应激组1只母鼠未受孕,将其排除。随后即断头取脑组织,采用Western-blot方法检测母鼠和子鼠大脑海马DCX的水平。实验结果用Excel 2003和SPSS 13.0统计软件进行分析处理。结果以均数±标准差（x±SD）表示,采用单因素方差分析（ANOVA）、t检验（T-test）、非参数检验和重复测量的方差分析进行组间均数比较,P<0.05为差别有统计学意义,P<0.01为差别有高度统计学意义。结果:1.开场实验1)母鼠:母鼠应激前,Con+NS组、Con+Flu组、Cus+Ns组和Cus+Flu组总路程、中央路程和周边路程相比差别没有统计学意义（P>0.05）。母鼠应激后组间比较,Con+Flu组与Con+NS组相比,总路程增加（P<0.05）;Con+Flu组与Cus+Flu组相比,总路程、周边路程明显增加（P<0.01）。Cus+Flu组应激前后比较,总路程、中央路程和周边路程均明显减少（P<0.01）。2)子鼠:一月龄子代雌鼠和雄鼠总路程、中央路程和周边路程差别无统计学意义（P>0.05）。总路程方面,Cus+NS组与Con+NS组母鼠所产子鼠相比,总路程增加（P<0.05）;Cus+Flu组与Con+Flu组母鼠所产子鼠相比,总路程明显增加（P<0.01）;中央路程方面,Con+NS组、Con+Flu组、Cus+NS组和Cus+Flu组母鼠所产子鼠中央路程相比差别无统计学意义（P>0.05）;周边路程方面,Cus+NS组与Con+NS组母鼠所产子鼠相比,周边路程增加（P<0.05）;Cus+Flu组与Con+Flu组母鼠所产子鼠相比,周边路程明显增加（P<0.01）;Cus+Flu组与Cus+NS组母鼠所产子鼠相比,周边路程明显增加（P<0.05）。性别对二月龄子代大鼠的总路程、周边路程有明显影响,雌鼠与雄鼠相比,总路程和周边路程均明显增加（P<0.01）;性别对二月龄子代大鼠的中央路程有所影响,雄鼠与雌鼠相比,中央路程增加（P<0.05）。母鼠四种处理方式对其所产二月龄雄鼠和雌鼠总路程、中央路程和周边路程差别均没有统计学意义（P>0.05）。2.蔗糖水消耗试验1)母鼠:母鼠应激前,Con+NS组、Con+Flu组、Cus+NS组和Cus+Flu组在蔗糖水消耗量、蔗糖水消耗百分比差异无统计学意义（P>0.05）。母鼠应激后,Cus+NS组蔗糖水消耗量明显低于其他3组（P<0.05）;蔗糖水消耗百分比在4组间差别无统计学意义（P>0.05）。Cus+Flu组应激后与应激前相比,蔗糖水消耗量明显增加（P<0.05）。2)子鼠:性别对一月龄子代大鼠糖水消耗量有影响,雌鼠与雄鼠相比,糖水消耗量较少（P<0.05）;性别对一月龄子代大鼠糖水消耗百分比没有影响,雌鼠与雄鼠相比差别无统计学意义（P>0.05）。母鼠四种处理方式对其所产一月龄雄鼠和雌鼠糖水消耗量及糖水消耗百分比相比差别均无统计学意义（P>0.05）。性别对二月龄子代大鼠糖水消耗量和糖水消耗百分比均没有影响,雌鼠与雄鼠相比差别无统计学意义（P>0.05）。母鼠四种处理方式所产二月龄子代大鼠糖水消耗量和糖水消耗百分比差别均无统计学意义（P>0.05）。3.强迫游泳实验1)母鼠:母鼠15 min的预游泳结果显示组间不动时间无差异（F（3,20）=0.452, P>0.05）;但5 min的游泳测试结果示组间有显著差异（F（3,20）=4.755, P<0.05） ,CUS+NS组的不动时间显著长于其它各组,而NS组、Flu组和CUS+Flu组间无差异。2)子鼠:一月龄、二月龄子代雄鼠与雌鼠相比差别无统计学意义（P>0.05）;母鼠四种处理方式所产一月龄子代大鼠5min强迫游泳不动时间差别无统计学意义（P>0.05）; Cus+NS组与Cus+Flu组母鼠所产二月龄子代大鼠相比,强迫游泳不动时间延长（P<0.05）。4.水迷宫实验1)母鼠定位航行:定位航行实验中,Con+NS组、Con+Flu组、Cus+NS组和Cus+Flu组的大鼠找到隐匿平台的逃避潜伏期均随着训练天数的增加逐渐减少（P<0.05）,但时间和分组的交互作用无统计学意义（P>0.05）,说明时间因素的作用不随着分组的不同而不同;个体间变异部分的计算结果显示,Cus+NS组与Con+NS组相比,逃避潜伏期延长（P<0.05）。母鼠空间探索:空间探索实验中,Cus+Ns组与Con+Ns组相比,穿越平台次数减少（P<0.05）。2)子鼠:一、二月龄子代大鼠定位航行实验中寻找隐匿平台的逃避潜伏期随着训练天数的增加逐渐减少（P<0.05）,但时间和性别的交互作用无统计学意义（P>0.05）,说明时间因素的作用不随着性别的不同而不同;个体间变异部分的计算结果显示,一、二月龄子代雄鼠与雌鼠寻找隐匿平台的逃避潜伏期差别无统计学意义（P>0.05）。一、二月龄子代大鼠定位航行实验中寻找隐匿平台的逃避潜伏期随着训练天数的增加逐渐减少（P<0.05）,但时间和分组的交互作用无统计学意义（P>0.05）,说明时间因素的作用不随着分组的不同而不同;个体间变异部分的计算结果显示,分组因素不起作用（P>0.05）。空间探索实验中,一、二月龄子代雄鼠与雌鼠相比,穿越平台的次数差别无统计学意义（P>0.05）。Con+NS组、Con+Flu组、Cus+NS组和Cus+Flu组的母鼠所产一、二月龄子代大鼠穿越平台次数差别无统计学意义（P>0.05）。5.Western blot1)母鼠:四个组的母鼠海马DCX和DCX/actin相比差别均无统计学意义（P>0.05）。2)子鼠:一月龄子代雄鼠与雌鼠海马DCX和DCX/actin相比差别无统计学意义（P>0.05）。Cus+Ns组与Con+NS组母鼠所产一月龄子代大鼠海马DCX相比, DCX减少（P<0.05）。母鼠四种处理方式所产一月龄子代大鼠海马DCX/actin相比差别无统计学意义（P>0.05）。二月龄子代雄鼠与雌鼠海马DCX和DCX/actin相比差别无统计学意义（P>0.05）。母鼠四种处理方式所产二月龄子代大鼠海马DCX和DCX/actin相比差别无统计学意义（P>0.05）。结论:1.自发活动:21d CUS导致母鼠产生焦虑样行为,自发活动的总路程和周边路程都有增加,预防性应用氟西汀逆转了应激所致的焦虑样行为,导致自发活动的减少。一月龄子代大鼠自发活动不会因性别的不同而不同。经过21d慢性应激后,一月龄子代大鼠焦虑样行为增多,说明母鼠孕前慢性应激对一月龄子代有致焦虑的作用,孕前腹腔注射氟西汀不能完全逆转母鼠孕前慢性应激所致一月龄子代的焦虑样行为;二月龄子代大鼠自发活动有明显的性别差异,二月龄雌鼠与雄鼠相比总路程和周边路程都增加,说明雌鼠与雄鼠相比更容易表现焦虑样行为,雄鼠与雌鼠相比中央路程增加,中央路程反映了大鼠的探究行为,说明二月龄雄鼠更易产生探究行为。2.蔗糖水消耗实验:母鼠经过21d慢性不可预测性应激（CUS）后蔗糖水消耗下降,我们用蔗糖水消耗实验来反映快感缺失这种类抑郁样行为,说明母鼠产生了类抑郁样行为。一月龄子代雌鼠与雄鼠相比,雌鼠更易产生快感缺失这种类抑郁样行为。母鼠孕前慢性应激并不能对一月龄子代大鼠产生快感缺失的作用,母鼠氟西汀的预防性应用并不能增加一月龄子代糖水的消耗量。二月龄子代雌鼠与雄鼠蔗糖水消耗量和蔗糖水消耗百分比相比差别无统计学意义,说明可能随着子代大鼠年龄的增长,这种抑郁样行为在性别方面的差异变的不明显。3.强迫游泳:母鼠经过21d慢性不可预测性应激（CUS）后强迫游泳不动时间明显延长。一月龄子代大鼠的不动时间在性别和组别方面都没有差别,而二月龄子代大鼠在性别方面不动时间没有差别,而在组别方面,母鼠孕前慢性应激导致所产二月龄子代不动时间延长,不动时间反映了类抑郁样行为,说明母鼠孕前慢性应激可能使子代产生了类抑郁样行为。氟西汀治疗不能逆转大鼠强迫游泳不动时间的延长。4.水迷宫实验:孕前慢性应激导致了母鼠空间记忆获得的受损,同时,空间探索实验中穿越平台的次数也比对照组减少,说明应激组母鼠记忆的提取受损。氟西汀预防性应用对抑郁母鼠空间记忆获得和提取的受损可能并没有改善作用。性别因素对水迷宫实验的影响并不大。孕前慢性应激的母鼠可能对其子代空间记忆的获得和提取均没有影响,氟西汀的预防性应用可能不会明显提高子代在水迷宫实验中的成绩。5.Western blot:母鼠孕前慢性应激并未导致母鼠海马神经元再生减少,可能与母鼠生产和哺乳具有提升大鼠情绪的作用有关,这种作用抵消了应激导致的海马神经元再生的减少。母鼠孕前慢性应激导致一月龄子代大鼠海马神经元再生减少,氟西汀的预防性应用并不能逆转这种再生减少。母鼠孕前慢性应激并未导致二月龄子代大鼠海马神经元再生减少,可能随着大鼠年龄的增长,海马神经元的再生能力下降,导致这种差别变得不明显。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 第一章 前言
• 第二章 实验材料与方法
• 1. 实验材料
• 1.1 实验对象
• 1.2 实验仪器
• 1.3 实验试剂及耗材
• 2. 实验方法
• 2.1 动物分组
• 2.2 实验流程
• 2.3 孕前慢性应激模型制备
• 2.4 开场试验（open field test,OFT）
• 2.5 蔗糖水消耗实验（sucrose consumption test）
• 2.6 强迫游泳实验（Forced swimming test,FST）
• 2.7 Morris水迷宫实验（Morris Water Maze, MWM）
• 2.8 Western-blot检测大鼠海马DCX的水平
• 2.9 统计方法
• 第三章 结果
• 1. 四种不同处理方式对母鼠及其子代大鼠自发活动的影响
• 1.1 四种不同处理方式对母鼠自发活动的影响
• 1.2 母鼠四种不同处理方式对子代大鼠自发活动的影响
• 2. 四种不同处理方式对母鼠及其子代大鼠糖水消耗的影响
• 2.1 四种不同处理方式对母鼠糖水消耗的影响
• 2.2 母鼠四种不同处理方式对子代大鼠糖水消耗的影响
• 3. 四种不同处理方式对母鼠及其子代大鼠强迫游泳不动时间的影响
• 3.1 四种不同处理方式对母鼠强迫游泳不动时间的影响
• 3.2 母鼠四种不同处理方式对子代大鼠强迫游泳不动时间的影响
• 4. 四种不同处理方式对母鼠及其子代大鼠水迷宫实验的影响
• 4.1 四种不同处理方式对母鼠水迷宫实验的影响
• 4.2 母鼠四种不同处理方式对子代大鼠水迷宫实验的影响
• 5. 四种不同处理方式对母鼠及其子代大鼠海马DCX及DCX/actin比值的影响
• 5.1 四种不同处理方式对母鼠海马DCX及DCX/actin比值的影响
• 5.2 母鼠四种不同处理方式对其所产子代大鼠海马DCX及DCX/actin比值的影响
• 第四章 讨论
• 1. 母鼠不同处理方式对母鼠及其子代大鼠自发活动的影响
• 2. 母鼠不同处理方式对母鼠及其子代大鼠糖水消耗的影响
• 3. 母鼠不同处理方式对母鼠及其子代大鼠强迫游泳不动时间的影响
• 4. 母鼠不同处理方式对母鼠及其子代大鼠水迷宫实验的影响
• 5. 母鼠不同处理方式对母鼠及其子代海马DCX及DCX/actin的影响
• 第五章 总结
• 1. 对本研究的简单总结
• 1.1 研究结果
• 1.2 初步结论
• 2. 今后要做的工作
• 参考文献
• 论著
• 致谢
• 个人简介