甘薯抗病调控关键基因Rar1的克隆及特性分析

论文摘要

甘薯不仅是日常生活中重要的粮食，还在农业、工业等方面发挥着重要的作用。由于病虫害的发生已经严重威胁甘薯的产量与品质。研究表明，通过利用SAR反应的相关基因NPR1等来获得广谱抗病性，是一条极其有效的途径。本研究以甘薯栽培品种金山57为研究材料，利用RT-PCR结合RACE技术克隆甘薯抗病防卫调控蛋白编码基因Rar1的全长cDNA序列，并构建了Rar1基因的过量表达载体，利用农杆菌介导法转化烟草，为探明该基因在甘薯抗病防卫反应中的作用机制提供研究基础。研究结果如下：1.甘薯Rar1基因的分离：通过RT-PCR结合RACE技术获得目的基因Rar1全长cDNA序列。该基因共含672bp，编码222个氨基酸，包含CHORD-I、CHORD-II（CHORD-I结构域从第6个氨基酸到第65个氨基酸，序列CQRIG CNAFFTEDDN PEGSCTYHDS GPLFHDGMKEWSCCKKRSHD FSLFLEIPGC KTGKH；CHORD-II结构域从第156个氨基酸到第215个氨基酸，序列为TCKNK GCGKTFTEKE NHDTACSYHP GPAIFHDRMR GWKCCDIHVK EFDEFMAIPP CTKGW），和一个CCCH结构域的保守区域。该基因与烟草Rar1基因同源性最高，同源性为99%。2.Rar1基因在甘薯中的表达模式：利用RT-PCR分析表明，甘薯Rar1基因在甘薯根、茎、叶中均有表达，为组成型表达；同时通过研究在3mM水杨酸喷施下，1h、8h、12h、24h后目的基因Rar1的表达量情况，发现在一定浓度的水杨酸喷施后，可以提高目的基因的表达量。3.甘薯Rar1基因转化烟草：以pEGC5941作为原始载体，构建Rar1基因过量表达载体，通过农杆菌介导法转化烟草，得到转基因植株为20株，其中10株为阳性植株，转化率为50%；利用qRT-PCR分析，表明转基因植株甘薯Rar1基因的表达量是未转基因烟草的9倍。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1. 文献综述
• 1.1 植物抗病防卫调控反应的相关研究
• 1.1.1 植物抗病性反应
• 1.1.2 植物抗病信号传导途径
• 1.1.3 植物抗病反应相关转录因子
• 1.2 植物抗病防卫调控相关基因的研究
• 1.2.1 植物抗病基因
• 1.2.2 抗病反应关键调控蛋白编码基因的研究现状
• 1.3 甘薯相关研究进展
• 1.3.1 甘薯研究现状
• 1.3.2 甘薯抗病基因研究进展
• 1.4 植物基因工程研究的应用和展望
• 1.4.1 抗性基因工程
• 1.4.2 植物品质改良基因工程
• 1.4.3 植物杂种优势的利用
• 1.4.4 植物代谢工程
• 1.5 本研究的目的、意义及内容
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 材料与生长环境
• 2.1.2 药品及试剂盒
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 引物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 Rar1的分离与测序
• 2.2.2 Rar1在甘薯中的表达模式
• 2.2.3 甘薯Rar1基因转化烟草
• 3.结果与分析
• 3.1 Rar1分离与测序
• 3.1.1 甘薯总RNA完整性及纯度检测
• 3.1.2 目的基因部分编码区的获得
• 3.1.3 目的基因3’端和5’端的获得
• 3.1.4 甘薯Rar1基因编码区的扩增
• 3.1.5 甘薯Rar1基因核苷酸序列分析
• 3.1.6 甘薯Rar1基因氨基酸序列分析
• 3.1.7 甘薯Rar1基因蛋白质结构分析
• 3.1.8 甘薯Rar1基因系统进化分析
• 3.2 Rar1在甘薯中的表达模式
• 3.2.1 甘薯Rar1基因器官特异性检测
• 3.2.2 半定量RT-PCR检测甘薯Rar1基因在SA处理后的转录表达
• 3.3 通过功能获得的方法研究Rar1的生物学功能
• 3.3.1 Rar1基因真核表达载体的构建
• 3.3.2 农杆菌目的基因PCR检测
• 3.3.3 转基因烟草阳性植株检测
• 3.3.4 荧光定量PCR检测目的基因表达量
• 4. 讨论
• 4.1 甘薯Rar1基因的分离与克隆
• 4.2 Rar1基因在甘薯中的表达模式
• 4.3 甘薯Rar1基因转化烟草
• 4.4 后续工作
• 5. 结论
• 参考文献
• 附录载体图谱
• 致谢