论文摘要
第一章大鼠视皮层神经元原代培养目的通过原代培养新生大鼠视皮层神经元,探求视皮层神经元的最佳分离和培养方法,提高原代培养神经元的纯度及活性,为视皮层相关性眼病的临床基础研究提供实验模型。方法取出生后1～3d清洁级SD大鼠,定位视皮层,以酶消化法分离视皮层神经元,应用含10%新生牛血清、10%F-12 NutrientMixtures的DMEM培养基进行接种培养,含2%B-27 Serum-FreeSupplements的Neurobasal Medium进行维持培养。利用尼氏染色进行神经元鉴定。结果接种1h后大部分细胞已贴壁。2～3h后见少数细胞长出较短的突起。24h后长出突起的神经元数目逐渐增多,突起长度增加。10d后神经元突起长度可达自身胞体直径的10倍以上,并形成复杂的网络结构。15～16d后神经元开始发生退化。镜下非神经元细胞形态与神经元存在差别并易区分。6d后非神经元细胞逐渐减少。神经元经尼氏染色后胞浆呈蓝紫色,尼氏小体颗粒状,结构清晰。非神经元细胞胞浆基本不着色,胞核淡紫色圆形,核仁清晰可辨。神经元比例为40%～50%。结论1.培养视皮层神经元生长良好,活性佳,易与非神经元细胞鉴别。2.尼氏染色显示培养神经元比例约为40%～50%。第二章培养大鼠视皮层神经元γ-氨基丁酸激活电流的特点目的探讨培养大鼠视皮层神经元γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid,GABA）-激活电流的特点。方法选择培养第11～14d形态典型、状态良好的视皮层神经元,应用膜片钳技术以全细胞模式记录其GABA-激活电流(IGABA)。结果1.大部分受检细胞（85.42%,41/48）对GABA敏感。同一细胞IGABA幅值与GABA浓度呈剂量依赖关系:随浓度增大IGABA幅值逐渐增大。不同细胞上予以相同浓度的GABA,IGABA幅值不同。2.IGABA具有明显的去敏感现象,应用双刺激法检测IGABA的去敏感时程,发现GABAA受体的去敏感恢复时间为5min。3.IGABA可被GABAA受体的选择性拮抗剂荷包牡丹碱（Bicuculline）阻断,可被特异性GABAA受体激动剂蝇覃醇（Muscimol）模拟。4.IGABA反转电位为0mV左右,接近Cl-平衡电位。5.IGABA幅值稳定,比较各时间点（0～30min）测得的变化率,差异无显著性（P＞0.05）。将各时间点的结果总和得到IGABA平均变化率为4.51±3.02%。结论1.大部分培养大鼠视皮层神经元对GABA敏感。2.IGABA具有剂量依赖性及明显的去敏感现象。3.IGABA幅值稳定,平均变化率为4.51±3.02%。第三章:多巴胺对培养大鼠视皮层神经元GABA-激活电流的作用目的探讨多巴胺（Dopamine,DA）对培养大鼠视皮层神经元GABA-激活电流的作用。方法选择培养第11～14d形态典型、状态良好的视皮层神经元,应用膜片钳技术以全细胞模式记录IGABA。在不同时间点于细胞外液中分别加入不同浓度的DA、D1受体选择性激动剂SKF38393、D2受体选择性激动剂Quinpirole,联合应用SKF38393与D1受体拮抗剂SCH23390、SKF38393与Quinpirole观察IGABA的变化。结果1.IGABA对DA存在剂量及时间依赖效应。预加DA可减小IGABA,加入10μM～500μM DA后,IGABA的变化率与对照组相比差异有显著性（P＜0.05）,其中50μM的剂量产生的作用最为显著。DA作用2～6min后,IGABA的变化率与对照组相比差异有显著性（P＜0.05）。抑制作用一般在预加4min后达到稳定。2.IGABA对D1受体选择性激动剂SKF38393存在剂量及时间依赖效应。预加SKF38393可减小IGABA,加入1μM～100μM SKF38393后,IGABA的变化率与对照组相比差异有显著性（P＜0.05）,剂量超过10μM后作用基本趋于稳定。10μM SKF38393作用3～6min后与对照组相比差异有显著性（P＜0.05）。抑制作用一般在预加4min后达到稳定。应用D1受体拮抗剂SCH23390（10μM）可显著减小SKF38393（10μM）对IGABA的抑制作用,差异有显著性（P＜0.05）。3.单独应用10μM、100μM、1mM D2受体选择性激动剂Quinpirole 5min、10min后对IGABA无明显作用。4.与单独应用SKF38393（10μM）相比,联合应用SKF38393（10μM）及Quinpirole（10μM）4～6min后对IGABA的抑制作用减弱,在5min组差异有显著性（P＜0.05）。结论1.IGABA可被DA、D1受体选择性激动剂SKF38393抑制,其抑制程度与二者存在剂量及时间依赖性。D1受体拮抗剂SCH23390可显著减小SKF38393对IGABA的抑制作用。2.单独应用D2受体选择性激动剂Quinpirole对IGABA无明显作用。3.SKF38393及Quinpirole联合应用对IGABA的抑制作用较单独应用SKF38393减弱。