黄瓜磷脂酶Dα基因的克隆及其正反义表达载体的构建

论文摘要

磷脂酶D（PLD）是植物组织中普遍存在的一种酶。PLD及其产物PA在信号传导、膜脂降解中起重要作用,与植物胁迫密切相关。黄瓜作为主要的蔬菜,在种植过程中经常遇到盐害、干旱等逆境胁迫。本试验以‘新泰密刺’黄瓜为试材,用RT-PCR结合RACE法从黄瓜幼叶中克隆了PLD基因的全长序列,并构建其正反义表达载体,分别用农杆菌介导法和子房注射法进行了烟草和黄瓜的转基因研究,并利用RealTime-PCR法对NO3-胁迫下黄瓜PLD基因的表达进行了定量分析。主要结果如下:1利用RT-PCR结合RACE技术获得了黄瓜磷脂酶D基因,命名为cuPLDα,GenBank注册号为EF363796。2序列分析表明,cuPLDαcDNA全长2,756 bp,编码区2,427 bp,编码808个氨基酸,预测蛋白质分子量约为91.8 kD,等电点为5.37。黄瓜磷脂酶Dα存在C2结构域、IYIENQFF结构域和HKD结构域。黄瓜磷脂酶Dα属于磷脂酶Dα家族,不存在有意义跨膜螺旋结构。3提出一个新的解决基因克隆中基因突变的方法:通过拼接两个或以上阳性克隆的非突变区域,构建无突变全长cDNA。4利用RealTime-PCR法分析发现,经不同浓度NO3-处理0.5 h后,cuPLDα表达随NO3-浓度增加而增强。182 mmol/L的NO3-处理cuPLDα表达最强,为对照的4.66倍。5为研究黄瓜磷脂酶Dα的功能,构建其正义表达载体pBI121-cuPLD和反义表达载体pBI121-PLD1,并分别通过农杆菌侵染法和子房注射法转化了烟草和黄瓜。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 磷脂酶D 的克隆及其家族
• 1.2 磷脂酶D 的氨基酸结构域
• 1.2.1 HKD 结构域
• 1.2.2 IYIENQFF 结构域
• 1.2.3 C2 结构域
• 2 结合域'>1.2.4 PIP₂结合域
• 1.2.5 PX 结构域
• 1.2.6 PH 结构域
• 1.3 磷脂酶D 的研究方法
• 1.4 磷脂酶D 的生化特性
• 1.4.1 磷脂酶D 的底物特异性
• 2+调控'>1.4.2 磷脂酶D 活性受Ca²⁺调控
• 1.4.3 磷脂酶D 活性受pH 调控
• 1.4.4 磷脂酰肌醇磷酸类对磷脂酶D 活性的调控
• 1.5 磷脂酶D 的分布和亚细胞定位
• 1.6 磷脂酶D 对环境胁迫的响应和信号传导功能
• 1.6.1 激素
• 1.6.2 渗透胁迫
• 1.6.3 低温胁迫
• 1.6.4 机械损伤
• 1.6.5 病原伤害
• 1.6.6 磷胁迫
• 1.7 展望
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料及处理
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶及生化试剂
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 CTAB 法提取黄瓜总RNA
• 2.2.2 RNA 电泳检测
• 2.2.3 反转录cDNA 第一条链的合成
• 2.2.4 cDNA 纯化（用于5′RACE）
• 2.2.5 cDNA 末端加尾（用于5′RACE）
• 2.2.6 黄瓜磷脂酶DαcDNA 全长序列的获得
• 2.2.7 琼脂糖凝胶中DNA 片段的回收
• 2.2.8 DNA 片段与克隆载体的连接
• 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.10 大肠杆菌的转化及筛选
• 2.2.11 碱法小量提取质粒DNA
• 2.2.12 DNA 序列的测定
• 3^-盐处理下黄瓜磷脂酶Dα基因表达分析'>2.2.13 不同浓度NO₃^-盐处理下黄瓜磷脂酶Dα基因表达分析
• 2.2.14 黄瓜磷脂酶Dα基因反义表达载体的构建
• 2.2.15 黄瓜磷脂酶Dα基因正义表达载体的构建
• 2.2.16 农杆菌感受态细胞的制备与转化
• 2.2.17 子房注射法转化黄瓜
• 2.2.18 黄瓜PLDα序列的生物信息学分析
• 3 结果与分析
• 3.1 黄瓜磷脂酶DΑ基因的分离
• 3.1.1 RNA 的提取及反转录
• 3.1.2 中间片段一和片段二的分离
• 3.1.3 3′片段的分离
• 3.1.4 5′片段的分离
• 3.1.5 全长cDNA 的分离
• 3.1.6 无突变全长cDNA 的构建
• 3.2 黄瓜磷脂酶DΑ的序列分析
• 3.2.1 黄瓜磷脂酶Dα核苷酸序列及推导的氨基酸序列
• 3.2.2 黄瓜磷脂酶Dα氨基酸保守域分析
• 3.2.3 磷脂酶D 序列相似性分析
• 3.2.4 磷脂酶D 系统发生分析
• 3.2.5 黄瓜磷脂酶Dα疏水性分析
• 3.3 N03-盐处理下黄瓜磷脂酶DΑ基因的表达分析
• 3.3.1 目标基因与内参基因扩增效率一致性的检测
• 3.3.2 目标基因与内参基因融解曲线分析
• 3^-盐处理下黄瓜磷脂酶Dα基因的表达'>3.3.3 NO₃^-盐处理下黄瓜磷脂酶Dα基因的表达
• 3.4 黄瓜磷脂酶DΑ基因正反义表达载体的构建
• 3.4.1 黄瓜磷脂酶Dα反义表达载体的构建
• 3.4.2 黄瓜磷脂酶Dα正义表达载体的构建
• 3.5 黄瓜磷脂酶DΑ转基因研究
• 4 讨论
• 4.1 RNA 的提取
• 4.2 基因全长的获得
• 4.3 无突变全长CDNA 的获得
• 4.4 利用反义RNA 技术研究基因功能
• 3^-处理下黄瓜磷脂酶DΑ的表达'>4.5 N0₃^-处理下黄瓜磷脂酶DΑ的表达
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文