论文摘要
目的:利用分子克隆技术克隆人野生型全长AE2 cDNA ,构建出pcDNA3.1-wt-AE2重组表达质粒,进行测序鉴定,并检测该表达质粒对内皮细胞系HUVECs AE2基因表达的影响,为进一步研究AE2在疾病中的生物学功能提供物质基础。方法:1.用DMEM+10%FBS培养基培养人HeLa细胞,从HeLa细胞中提取总RNA;自行设计上下游各带有NheⅠ和HindⅢ限制性酶切位点的PCR引物,采用RT-PCR技术,将总RNA反转录成cDNA,再扩增出AE2基因全长cDNA片段。2.用限制性核酸内切酶NheⅠ和HindⅢ分别双酶切pcDNA3.1质粒和AE2 cDNA片段,电泳分离后回收纯化两端带不同粘性末端的pcDNA3.1质粒和AE2 cDNA片段;用T4DNA连接酶连接pcDNA3.1质粒和AE2片段,将连接产物转化入感受态细胞TOP10,在含有终浓度为50mg/mlAmp的LB固体培养基中筛选培养24h后,挑取单个阳性菌落扩增,提取并纯化重组体质粒pcDNA3.1-wt-AE2。3.用三种方案的限制性核酸内切酶酶切鉴定所构建重组载体pcDNA3.1-wt- AE2,得出肯定结果后通过DNA测序进一步鉴定。4.将绿色荧光蛋白质粒pEGFP-N2转染HUVECs,观察24h、36h、48h及72h绿色荧光的表达量,确定转染效率的时效关系而推测重组质粒pcDNA3.1-wt-AE2的最佳转染时间。5.将重组质粒pcDNA3.1-wt-AE2转染HUVECs,随机分为三个组:正常对照（Control）组、转染空质粒pcDNA3.1组、转染重组质粒pcDNA3.1-wt-AE2组。通过RT-PCR和Western Blotting检测HUVECs中AE2 mRNA和蛋白表达情况。结果:1.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,在预期位置显示了清晰的亮带,这一结果提示已成功扩增出了特异性的目的基因AE2 cDNA。2.将分别双酶切后的pcDNA3.1质粒和AE2 cDNA片段用T4DNA连接酶进行连接反应后,转化感受态细胞TOP10,经Amp筛选,在培养皿上可见阳性菌落;挑取单个阳性菌落进行扩增并提取纯化出重组体质粒pcDNA3.1-wt-AE2。3.分别经限制性核酸内切酶NheⅠ单切,NheⅠ和HindⅢ双切,SacⅠ单切后,酶切图谱结果显示与预期相符;进一步将重组体进行基因测序分析,证实本实验克隆的人AE2基因cDNA序列与Genebank[NM003040]公布的人AE2基因cDNA序列一致,这一结果表明重组体pcDNA3.1-wt-AE2中插入的目的基因AE2为正向、单倍插入。4.将质粒pEGFP-N2转染HUVECs内皮细胞后,在绿色荧光显微镜可见到绿色荧光,且48h的转染效率高达40%。5.AE2 mRNA的表达:AE2各组样本均由对应的β-actin条带的扫描值标化。Control组、转染空质粒pcDNA3.1组、转染重组质粒pcDNA3.1-wt- AE2组AE2 mRNA表达量分别为0.32±0.03,0.34±0.03, 0.90±0.12。AE2 mRNA在正常HUVECs中呈基础性表达;转染重组质粒pcDNA3.1-wt-AE2组HUVECs较Control组AE2 mRNA转录显著上调（P <0.001）;转染空质粒pcDNA3.1组与Control组相比无明显差异（P >0.05）。6.AE2蛋白的表达:AE2蛋白各组样本均由对应的β-actin蛋白条带的扫描值标化。Control组、转染空质粒pcDNA3.1组、转染重组质粒pcDNA3.1-wt-AE2组AE2蛋白表达量分别为0.25±0.04,0.28±0.04,1.89±0.05。AE2蛋白在正常HUVECs中呈基础性表达;转染重组质粒pcDNA3.1-wt-AE2组内皮细胞较Control组AE2蛋白表达显著增加（P <0.01）;转染空质粒pcDNA3.1组与Control组相比较无明显差异（P >0.05）。结论:1.我们成功克隆了人AE2基因野生型全长cDNA序列,并构建pcDNA3.1-wt-AE2重组质粒真核表达载体。2.重组质粒pcDNA3.1-wt- AE2可明显升高HUVECs AE2基因在mRNA和蛋白水平的表达。