NO3-胁迫下黄瓜CsNMAPK基因的分离及功能分析

论文摘要

土壤次生盐渍化是温室蔬菜生长的主要障碍之一,严重影响栽培设施的利用效率和设施蔬菜栽培的可持续高效发展。温室土壤的盐分组成特点和滨海、内陆盐土不同,其阴离子主要是NO3-。目前前人对盐胁迫对植物的伤害机理方面的研究已取得了长足进展,但多以NaCl处理作为研究手段,而温室土壤中NO3-积累造成蔬菜伤害的分子机理缺乏深入系统的研究。黄瓜是我国日光温室主栽的蔬菜种类之一,黄瓜根系浅,吸肥能力差,易受盐害。因此,研究设施黄瓜在NO3-胁迫条件下的抗性机理具有重要的理论和实践意义。MAPK级联途径是真核生物中广泛存在的逆境胁迫信号转导途径。MAPK级联途径由三类蛋白激酶组成:MAPKKK-MAPKK-MAPK,通过依次磷酸化传递环境信号。植物中的MAPK途径与其他信号途径交织在一起,形成了一个网络系统,参与生长发育和各种生物、非生物胁迫信号转导。近年来,在植物中分离到大量MAPKs,并在其作用机理研究方面取得了很大进展。然而,前人对植物中MAPK的研究主要集中在双子叶模式植物（拟南芥、烟草和紫花苜蓿等）,关于黄瓜MAPK方面的研究很少。为此,本试验以黄瓜为试材,对黄瓜MAPK进行了基因克隆、表达特性和功能的研究,主要结果如下:1.利用同源序列设计兼并引物,通过RT-PCR的方法,在黄瓜根中分离到黄瓜MAPK基因的中间片段,再通过5′RACE和3′RACE分别克隆到黄瓜MAPK基因的5′片段和3′片段,拼接后设计特异引物扩增到黄瓜MAPK基因全长cDNA,命名为CsNMAPK（基因注册号:DQ812086）。该基因全长1636 bp,有开放阅读框1113 bp,编码370个aa。2.同源序列比较发现,黄瓜MAPK基因与已知的棉花、豌豆、苜蓿、马铃薯、番茄、辣椒的同源性分别为85.18 %、84.91 %、84.64 %、83.65 %、83.11%、81.60 %。对来自番茄、马铃薯、棉花等MAPK蛋白进行分子聚类分析,构建了MAPK蛋白的系统进化树,分析结果表明,CsNMAPK蛋白与棉花GmMAPK1、豌豆的PsMAPK3蛋白亲缘关系最近。聚类分析还表明CsNMAPK蛋白属于MAPK的Ⅰ类,预示可能在环境胁迫和激素信号转导中起着重要作用。3.Northern blot分析表明CsNMAPK受NO3-胁迫强烈诱导表达。56、98、140 mM NO3-处理后,该基因的表达量上升,182 mM NO3-处理后该基因的表达量下降。182 mM NO3-处理后该基因在黄瓜叶、茎和根中均有表达,且表达量差异不大。182 mM NO3-处理耐盐品种‘新泰密刺’10 min后该基因的表达量开始上升,处理30 min后表达量达到最大,随后开始下降;而盐敏感品种‘神农春五’的表达量在60 min达到最大。CsNMAPK也能被NaCl、ABA、H2O2、PEG和SA等诱导。4.利用农杆菌侵染法将pBI-CsNMAPK转入烟草中,通过PCR和Northern blot检测表明CsNMAPK已经插入烟草基因组中并且已经表达。通过种子萌发期NO3-抗性试验表明,转基因烟草种子的抗性提高。通过苗期NO3-胁迫试验表明,转基因烟草抗性提高。为了检测转CsNMAPK基因烟草抗性提高的原因,我们测定了一系列和植物逆境胁迫有密切关系的生理指标,包括MDA含量、膜透性、H2O2含量、抗氧化物酶活性（SOD、POD、CAT、APX）、净光合速率、游离脯氨酸的积累等。结果表明,未处理的转基因烟草和野生型烟草的这些指标没有明显差别。但是胁迫处理后,转基因植株中电解质相对渗漏率、MDA和H2O2含量都显著低于野生型植株;转基因植株中SOD、CAT、POD和APX酶活性均高于野生型植株,具有更高的活性氧清除能力;脯氨酸含量增加的更多,具有较强的渗透调节能力。5.构建了原核表达载体pET-CsNMAPK,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,免疫小白鼠,制备抗体。Western杂交表明,转正义植株中CsNMAPK已在蛋白水平过量表达。6.用子房注射法将携带CsNMAPK基因的正义和反义表达载体的质粒导入六个黄瓜品种中,T1代幼苗叶片用2500 mg/L的卡那霉素涂抹筛选,对未变黄的植株进行PCR和Real-time PCR检测,获得了8株转基因黄瓜植株,其中3株反义转基因植株,5株正义转基因植株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写符号及其中英文对照表
• 1 引言
• 1.1 植物对盐胁迫适应机理
• 1.1.1 解毒作用
• 1.1.2 维持体内离子和渗透平衡
• 1.1.3 生长调节
• 1.2 逆境胁迫的信号途径
• 1.2.1 依赖Ca2+的CDPK 信号途径
• 2+的SOS 信号途径'>1.2.2 依赖Ca²⁺的SOS 信号途径
• 2+的MAPK 信号途径'>1.2.3 不依赖Ca²⁺的MAPK 信号途径
• 1.3 MAPK 级联系统
• 1.3.1 植物中的MAPKs
• 1.3.2 MAPKs 在植物环境胁迫信号转导中的作用
• 1.3.2.1 MAPKs 与植物生物胁迫信号转导
• 1.3.2.2 MAPKs 与植物非生物胁迫信号转导
• 1.3.2.2.1 MAPKs 在干旱、高盐和低温胁迫下的信号转导
• 1.3.2.2.2 MAPKs 在机械损伤胁迫下的信号转导
• 1.3.2.2.3 MAPKs 在重金属胁迫下的信号转导
• 1.3.2.2.4 MAPKs 在臭氧辐射下的信号转导
• 1.3.3 MAPKs 与植物激素信号转导
• 1.3.3.1 MAPKs 与ABA 信号转导
• 1.3.3.2 MAPKs 与乙烯信号转导
• 1.3.3.3 MAPKs 与生长素信号转导
• 1.3.3.4 MAPKs 与赤霉素信号转导
• 1.3.3.5 MAPKs 与水杨酸信号转导
• 1.3.4 MAPKs 与氧化胁迫信号转导
• 1.3.5 植物MAPKs 与胞质分裂和发育
• 1.3.6 MAPK 级联系统的复杂性和特异性
• 1.4 植物耐盐基因工程进展
• 1.5 本研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料及处理
• 2.1.1.1 供试材料
• 2.1.1.2 试验处理
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶及生化试剂
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.1.5 培养基（见附录）
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 植物材料总RNA 的提取
• 2.2.2 反转录cDNA 第一条链的合成
• 2.2.3 cDNA 纯化（用于5′RACE）
• 2.2.4 对cDNA 进行末端加尾（用于5′RACE）
• 2.2.5 cDNA 全长序列的获得
• 2.2.5.1 兼并引物PCR 获得黄瓜CsNMAPK 基因的中间片段
• 2.2.5.2 3′RACE 获得3′端序列
• 2.2.5.3 5′RACE 获得5′端序列
• 2.2.5.4 cDNA 全长序列的获得
• 2.2.6 DNA 片段与克隆载体的连接
• 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.7.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.7.2 大肠杆菌感受态细胞的转化及克隆筛选
• 2.2.8 碱法质粒DNA 的提取
• 2.2.9 质粒DNA 的酶切鉴定
• 2.2.10 DNA 序列测定
• 2.2.11 凝胶电泳中DNA 片段的回收
• 2.2.12 地高辛（DIG）标记的Northern blot
• 2.2.13 黄瓜CsNMAPK 的原核表达及抗体制备
• 2.2.13.1 原核表达载体的构建（图4）
• 2.2.13.2 E.coli BL21 原核表达的诱导
• 2.2.13.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.13.4 抗体的制备
• 2.2.14 Western blot
• 2.2.15 CsNMAPK 基因正义和反义表达载体的构建
• 2.2.15.1 CsNMAPK 正义表达载体的构建
• 2.2.15.2 CsNMAPK 反义表达载体的构建
• 2.2.16 根癌农杆菌LBA4404 感受态细胞的制备与转化
• 2.2.16.1 农杆菌感受态细胞制备
• 2.2.16.2 冻融法转化农杆菌
• 2.2.17 农杆菌介导的烟草的转化
• 2.2.17.1 农杆菌培养
• 2.2.17.2 烟草转化、培养和植株再生
• 2.2.18 基因组DNA 的提取（CTAB 法）
• 2.2.19 转基因烟草的PCR 筛选
• 2.2.20 转基因烟草种子的耐逆性分析
• 3^-胁迫对烟草幼苗生理特性的影响'>2.2.21 NO₃^-胁迫对烟草幼苗生理特性的影响
• 2.2.22 光合特性的测定
• 2.2.23 丙二醛含量的测定
• 2.2.24 电解质相对渗漏率的测定
• 2.2.25 抗氧化物酶活性的测定
• 2O₂的含量测定'>2.2.26 H₂O₂的含量测定
• 2.2.27 子房注射法转化黄瓜
• 2.2.28 卡那霉素涂抹叶片初步筛选转基因植株
• 2.2.29 实时荧光定量PCR
• 2.2.29.1 反转录反应
• 2.2.29.2 Real-Time PCR 测定
• 3 结果与分析
• 3.1 黄瓜CsNMAPK 基因的分离
• 3.2 CsNMAPK 基因的序列分析
• 3.3 黄瓜CsNMAPK 基因的表达情况
• 3^-胁迫下的表达分析'>3.3.1 CsNMAPK 在NO₃^-胁迫下的表达分析
• 3.3.2 CsNMAPK 在耐盐品种‘新泰密刺’和盐敏感品种‘神农春五’中的表达分析
• 3.3.3 CsNMAPK 在其它非生物胁迫下的表达分析
• 3.4 CsNMAPK 的原核表达及抗体制备
• 3.4.1 原核表达载体pET-CsNMAPK 的构建
• 3.4.2 重组蛋白表达与SDS-PAGE 分析
• 3.5 CsNMAPK 基因在烟草中的过表达及转基因烟草的耐逆性分析
• 3.5.1 转基因烟草表达载体pBI-CsNMAPK 的构建及转基因烟草的鉴定
• 3.5.2 转基因烟草的根系长度
• 3.5.3 转基因烟草种子的耐逆性分析
• 3.5.3.1 转基因烟草在含甘露醇的MS 培养基上的萌发情况
• 3.5.3.2 转基因烟草在含NaCl 的MS 培养基上的萌发情况
• 3^-的MS 培养基上的萌发情况'>3.5.3.3 转基因烟草在含NO₃^-的MS 培养基上的萌发情况
• 3^-胁迫抗性分析'>3.5.4 转基因烟草苗期的NO₃^-胁迫抗性分析
• 3^-胁迫对转基因烟草鲜重和干重的影响'>3.5.4.1 NO₃^-胁迫对转基因烟草鲜重和干重的影响
• 3^-胁迫对转基因烟草MDA 含量和电解质相对渗漏率的影响'>3.5.4.2 NO₃^-胁迫对转基因烟草MDA 含量和电解质相对渗漏率的影响
• 3^-胁迫对转基因烟草H₂O₂含量的影响'>3.5.4.3 NO₃^-胁迫对转基因烟草H₂O₂含量的影响
• 3^-胁迫对转基因烟草抗氧化物酶活性的影响'>3.5.4.4 NO₃^-胁迫对转基因烟草抗氧化物酶活性的影响
• 3^-胁迫对转基因烟草光合速率的影响'>3.5.4.5 NO₃^-胁迫对转基因烟草光合速率的影响
• 3^-胁迫对转基因烟草脯氨酸的影响'>3.5.4.6 NO₃^-胁迫对转基因烟草脯氨酸的影响
• 3.6 CsNMAPK 基因的正义和反义表达载体转化黄瓜
• 3.6.1 子房注射法将CsNMAPK 基因的正义和反义表达载体注入黄瓜
• 3.6.2 转基因黄瓜幼苗的卡那霉素初步筛选
• 3.6.3 转基因黄瓜的PCR 筛选
• 3.6.4 转基因黄瓜的Real-time PCR 检测
• 3.6.5 转反义CsNMAPK 基因黄瓜的株高
• 4 讨论
• 4.1 黄瓜CsNMAPK 基因的克隆及表达特性
• 4.2 过量表达CsNMAPK 基因提高了转基因烟草的耐旱和耐盐性
• 4.3 子房注射法转基因黄瓜的获得
• 5 结论
• 本文创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间文章发表情况