杂色鲍Toll样受体信号通路分子的克隆及表达分析

论文摘要

杂色鲍是我国南方沿海各省海水养殖的重要养殖贝类，但自90年代以来，养殖杂色鲍陆续爆发的大规模死亡，造成了巨大的经济损失，严重影响了杂色鲍养殖业的的健康可持续发展。引起杂色鲍大规模死亡原因是多方面的，其主要原因是养殖环境恶化、杂色鲍种质衰退以及抗病力下降。改良种质和培育抗病品系，开发免疫增强剂等是解决目前困扰杂色鲍养殖业健康可持续发展的必经之路，而所有这些途径的基础都需要对杂色鲍免疫防御机制有深刻的了解。TLR信号通路在免疫过程中具有重要作用，是研究杂色鲍免疫机制的首选对象之一。本研究通过EST序列分析和SMART RACE技术共获得6条杂色鲍（small abalone）TLR信号通路分子基因：两条革兰氏阴性菌结合蛋白（Gram-negative bacteria-binding proteins，GNBP）、白介素1受体相关激酶4（Interleukin-1receptor-associated kinases4，IRAK-4）、白介素1受体相关激酶1结合蛋白1（Interleukin-1receptor-associated kinases1bindingprotein1，IRAK1BP1）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF receptor-associated factor6，TRAF6）和肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）基因的全长cDNA，分别命名为saGNBP1、saGNBP2、saIRAK-4、saIRAK1BP1、saTRAF-6和saTNF-α，并采用Real time PCR分析这些基因的在杂色鲍组织表达、胚胎发育及经副溶血弧菌感染后的表达情况。结果如下：1)saGNBP1cDNA全长为1430bp，编码222个氨基酸。具有1个Glycosidehydrolase family16功能结构域。saGNBP2cDNA全长为1289bp，编码396个氨基酸。具有1个Glycoside hydrolase family16功能结构域。2)saIRAK-4cDNA全长为2062bp，编码516个氨基酸。包含丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能域和死亡功能域。Real time PCR结果显示saIRAK-4在鳃中表达量最高，在血淋巴中的表达量最低。在胚胎和幼虫发育过程中，saIRAK-4表达水平有显著性变化。弧菌感染12h后，saIRAK-4的表达量在鳃中显著性升高（p <0.05），24h后极显著性升高（p <0.01）。在血淋巴和肾中，感染3h后表达量显著性变化，6-24h恢复到正常水平。原位杂交分析显示，saIRAK-4在鳃上皮细胞中的杂交信号最强，说明了其该基因在鳃上皮细胞中表达量最高。3)saIRAK1BP1cDNA全长为1047bp，编码249个氨基酸。具有1个SIMPL功能结构域（45aa-240aa），1个蛋白质相互作用位点（197aa-204aa）。N端具有一段跨膜区域，C端具有一个核定位信号（NLS）。Real time PCR结果显示，saIRAK1BP1在血淋巴中表达量最高，在外套膜、粘液腺和肾中的表达量最低。在胚胎和幼虫发育过程中，saIRAK1BP1表达水平有显著性变化。在鳃中，弧菌感染后6h，表达量显著上调，达到极显著性水平（p <0.01）。在12h，表达量依然维持在很高的水平，达到显著水平（p <0.05）。在24h时，表达水平恢复到正常水平。在肾中，saIRAK1BP1在感染后6h，表达量显著上调（p <0.05），在12h和24h，表达水平恢复到正常。此外saIRAK1BP1蛋白在大肠杆菌中得到表达。4)saTRAF6cDNA全长为795bp读框编码170个氨基酸。包含1个RING结构域。Real time PCR结果显示，saTRAF6在肾和肝胰腺中表达量最高，在血淋巴中的表达量最低。弧菌感染后，在鳃和血淋巴中，saTRAF6感染后0-3h之间没有发生显著性变化，而在感染6h，表达量显著上调，达到显著性水平（p <0.05），在12、24h时，表达水平恢复到正常。5)saTNF-α cDNA全长为954bp编码250个氨基酸。具有N端信号肽序列和一个TNF结构域。Real time PCR结果显示，saTNF-α在肾中表达量最高，在外套膜、上足、肝胰腺和血淋巴中的表达量较低。在胚胎和幼虫发育过程中，saTNF-α表达水平发生显著性变化。弧菌感染后，在肾中，saTNF-α感染后3h表达水平显著升高（p <0.05），在6-24h时，表达水平恢复到正常。在血淋巴中，saTNF-α感染后12h表达量显著下降，达到显著性水平（p <0.05），在24h，表达水平恢复到正常。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 杂色鲍的养殖现状及面临的问题
• 1.1.1 杂色鲍的养殖
• 1.1.2 杂色鲍大规模疾病暴发
• 1.1.3 杂色鲍疾病原因分析
• 1.2 无脊椎动物的免疫研究
• 1.2.1 免疫系统研究的历程
• 1.2.2 先天性免疫与获得免疫的差异
• 1.2.3 无脊椎动物模式识别受体的研究
• 1.2.4 无脊椎动物两条免疫信号转导的途径（Signal transduction pathways）
• 1.2.5 Toll 和 Imd 信号通路的负性调节
• 1.2.6 无脊椎动物病原体的清除
• 1.3 表达序列标签在基因鉴别和克隆方面的应用
• 1.4 研究内容和目的意义
• 1.4.1 研究内容
• 1.4.2 本研究目的与意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要试剂和仪器
• 2.1.3 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总 RNA 的提取（RDP 法）和去除 DNA 的污染
• 2.2.2 合成 RT-PCR cDNA 第一链和 PCR 扩增获取基因 cDNA 片段
• 2.2.3 SMART-RACE 技术获取基因全长
• 2.2.4 割胶纯化基因片段
• 2.2.5 与质粒载体连接
• 2.2.6 感受态细胞的转化及筛选
• 2.2.7 质粒插入片段的检测
• 2.2.8 质粒测序
• 2.2.9 目的基因的生物信息学分析
• 2.2.10 实时荧光定量 PCR 反应体系及条件
• 2.2.11 数据分析
• 2.2.12 石蜡切片
• 2.2.13 HE 染色
• 2.2.14 原位杂交
• 2.2.15 蛋白原核表达
• 第3章 结果
• 3.1 杂色鲍血细胞总 RNA 的提取
• 3.2 RACE-PCR 扩增结果
• 3.3 saGNBP1、saGNBP2、saIRAK-4、saIRAK1BP1、saTRAF6 和 saTNF-α序列分析结果
• 3.3.1 saGNBP1 与 saGNBP2 cDNA 序列结果
• 3.3.2 saIRAK-4 cDNA 序列结果
• 3.3.3 saIRAK1BP1 cDNA 序列结果
• 3.3.4 saTRAF6 cDNA 序列结果
• 3.3.5 saTNF-α cDNA 序列结果
• 3.4 saIRAK-4、saIRAK1BP1、saTRAF6 和 saTNF-α基因的表达特征
• 3.4.1 saIRAK-4 基因的表达特征
• 3.4.2 saIRAK1BP1 基因的表达特征
• 3.4.3 saTRAF6 基因的表达特征
• 3.4.4 saTNF-α基因的表达特征
• 3.5 saIRAK-4 在鳃中的定位研究和 saIRAK1BP1 原核表达研究
• 3.5.1 saIRAK-4 在鳃中的定位研究
• 3.5.2 saIRAK1BP1 原核表达研究
• 第4章 讨论
• 4.1 革兰氏阴性菌结合蛋白
• 4.2 白介素 1 受体相关激酶
• 4.3 白介素 1 受体相关激酶 1 结合蛋白
• 4.4 肿瘤坏死因子受体相关分子
• 4.5 肿瘤坏死因子 α
• 第5章 结论和展望
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的学术论文和研究成果