STAT3在激光诱导的大鼠脉络膜新生血管中的表达及其对缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞血管内皮生长因子表达的影响

论文摘要

研究背景脉络膜新生血管（CNV）发生于多种眼部疾病,如年龄相关性黄斑变性（AMD）、眼组织胞浆菌病（OHS）、病理性近视和眼外伤等。CNV常累及黄斑,可因反复渗出、出血及瘢痕形成导致中心视力丧失,是主要致盲原因之一。当前眼科界关于CNV生成机制的研究已成为热点,以期寻找能够有效防治CNV的途径。CNV的病因尚未阐明,缺血缺氧可能是CNV形成重要的始动因素。局部微环境的改变可致脉络膜毛细血管闭塞、萎缩以及纤维化等引起脉络膜供血不足,因而视网膜缺血缺氧,刺激视网膜色素上皮（RPE）细胞分裂和增生,并分泌血管内皮生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等多种细胞因子,导致脉络膜毛细血管向外层视网膜代偿性生长,最后形成CNV。VEGF是迄今为止发现的作用最强的促血管形成因子,也是重要的促细胞分裂素,缺氧可上调其表达。RPE细胞是CNV中主要的细胞成分,缺氧诱导RPE细胞表达VEGF可能是CNV发生的关键环节。VEGF受多种刺激因素的影响,牵涉的分子生物学机制十分复杂,这使得以抑制VEGF为目的的治疗手段受到很大挑战。虽然VEGF的诱导因素众多,但研究表明缺氧诱导因子1 （HIF-1）和信号转导与转录激活因子3（STAT3）是细胞内两种关键性转录激活因子,可作用于VEGF启动子,直接调控VEGF的表达。HIF-1是缺氧反应中一个重要的调节因子,通过与基因启动子、增强子或其他调控区内的HIF-1特异组合序列结合,参与缺氧诱导VEGF等基因的表达,在血管形成过程中发挥重要作用。STATs是一类通过酪氨酸磷酸化激活的具有SH2同源结构域的转录因子家族,多种细胞因子和生长因子等多肽类配体可参与其激活。实验表明,STAT3参与了细胞对缺氧的应答,缺氧2h时即观察到肺动脉平滑肌细胞内磷酸化STAT3蛋白表达显著升高。近期研究发现,STAT3的异常活化在诱导肿瘤新生血管的形成中具有重要作用。缺氧可激活人肾癌细胞JAK2/STAT3信号转导通路,并通过活化HIF-1α蛋白协同调控VEGF表达,促进血管发生。目的（1）观察激光诱导的大鼠CNV形成早期磷酸化STAT3的定位; （2）建立体外培养的人RPE细胞物理缺氧模型,观察缺氧状态下RPE细胞STAT3的活性变化;（3）运用JAK2激酶抑制剂AG490研究JAK2/STAT3信号转导通路对缺氧诱导的体外培养的人RPE细胞增生以及HIF-1α活化和VEGF表达的影响。方法（1）建立激光诱导的BN大鼠CNV模型,以免疫荧光法观察CNV生成早期磷酸化STAT3的定位;（2）将培养的人RPE细胞置于含体积分数为1%O2、5%CO2和94%N2的培养箱内建立缺氧模型,分别培养1、3、6、12和24h。采用RT-PCR和Western blot方法观察STAT3及其磷酸化表达水平的变化,免疫荧光法观察RPE细胞内STAT3定位的改变;（3）用30μM JAK2激酶抑制剂AG490处理RPE细胞,在缺氧条件下分别培养1、3、6、12和24h,用流式细胞仪（flow cytometry, FCM）检测JAK2/STAT3信号通路阻断前后缺氧RPE细胞的增生指数,以RT-PCR和Western blot方法观察HIF-1αmRNA和蛋白的表达,RT-PCR观察VEGF mRNA表达,ELISA检测人RPE细胞上清中VEGF的含量。结果（1）在激光诱导的大鼠CNV生成第3d,即可见磷酸化STAT3高表达于CNV区域,且主要定位于参与CNV生成的增生移行的RPE细胞中;（2） RT-PCR和Western blot显示,正常培养的人RPE细胞内STAT3 mRNA和蛋白表达量微弱。随缺氧时间的延长,STAT3表达量逐渐增强,至12h达到峰值,24h开始下降,但仍高于常氧状态;免疫荧光显微镜观察,常氧状态下,STAT3蛋白荧光主要分布于RPE细胞胞质内。缺氧后,细胞质内绿色荧光强度减弱,细胞核荧光强度明显增强;（3） FCM检测AG490处理组细胞增生指数明显低于对照组（P<0.05）;随缺氧时间的增加,RT-PCR显示HIF-1αmRNA和VEGF mRNA表达逐渐增强,至6h达峰值;Western blot检测缺氧后HIF-1α逐渐被活化,至12h达到峰值,24h开始下降;AG490处理组较对照组中HIF-1αmRNA和VEGF mRNA的表达以及HIF-1α蛋白的活化均受到明显抑制;ELISA证实,缺氧条件下培养的人RPE细胞上清液中VEGF含量随时间逐渐增加,而AG490处理组RPE细胞条件培养液中VEGF含量显著低于对照组（P<0.05）。结论（1） RPE细胞内STAT3的磷酸化可能参与了激光诱导的大鼠CNV早期的发生过程;（2）缺氧可活化人PRE细胞内STAT3;（3）缺氧诱导的人RPE细胞高表达VEGF,可能部分是通过JAK2/STAT3信号转导通路实现的。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 第一部分 激光诱导的大鼠脉络膜新生血管中磷酸化STAT3 的免疫荧光定位
• 0 引言
• 1 主要材料、试剂和仪器
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分 缺氧诱导的体外培养人视网膜色素上皮细胞中5TAT3 的活化
• 0 引言
• 1 主要材料、试剂和仪器
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三部分 JAK2/STAT3 信号转导通路对缺氧诱导体外培养的人视网膜色素上皮细胞VEGF表达的影响
• 0 引言
• 1 主要材料、试剂和仪器
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢