虎杖提取物对人肺癌A549细胞株抑制增殖和诱导凋亡作用的研究

论文摘要

目的：研究虎杖提取物对人肺癌A549细胞株的抑制增殖及诱导凋亡作用，并探讨其作用机制，为新药开发提供实验和理论依据。方法：应用MTT法检测虎杖提取物对体外培养的人肺癌A549细胞株的抑制增殖作用的影响及细胞毒活性；通过倒置显微镜、HE染色、AO/EB荧光显微镜的方法观察肿瘤细胞的形态改变；应用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的脱氧核苷酸缺口末端标记（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）法检测虎杖提取物对细胞诱导凋亡的情况；采用流式细胞仪检测A549细胞株的细胞周期分布相和细胞凋亡率；通过免疫细胞化学S-P法测定凋亡关键酶Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9与凋亡相关基因产物bcl-2，以及与细胞周期有关的p21ras、Ki-67蛋白的表达情况，深入探讨虎杖提取物对人肺癌细胞株诱导凋亡的机制。结果：（1）MTT法检测结果表明：虎杖提取物在体外对A549人肺癌细胞株有明显的抑制增殖作用，实验组与对照组相比其生长抑制率有显著性差异（p＜0.01），而且这种抑制作用呈现浓度和时间的依赖性；（2）倒置显微镜观察：虎杖提取物40μg/ml作用后早期细胞出现凋亡形态学变化细胞膜出泡、凋亡小体形成等；作用晚期细胞发生膜破裂坏死；（3）HE染色：虎杖提取物40μg/ml作用细胞后出现典型凋亡形态变化凋亡小体形成、细胞核浓缩呈蓝黑色、胞浆呈淡红色等，核染色质浓缩、呈碎块状；（4）AO/EB荧光显微镜：实验组出现凋亡细胞；（5）TUNEL法检测结果：虎杖提取物40μg/ml作用细胞后凋亡细胞数目随时间延长而增多；加药组凋亡率与对照组相比有显著差异，同时凋亡指数呈时间依赖性和剂量依赖性；（6）流式细胞仪检测结果显示：虎杖提取物可以诱导A549细胞凋亡，加药组出现G0/G1期和G2/M期细胞比例显著增加（p＜0.01），而S期细胞比例则明显下降，将细胞阻滞在Go/G1期；（7）免疫组化化学结果表明：虎杖提取物作用后加药组Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9表达增强，Ki-67、p21ras蛋白随提取物浓度表达均降低，与对照组相比较均有显著性差异（p＜0.01）。结论：1．虎杖提取物在体外对人肺癌A549细胞株有显著的抑制增殖和诱导凋亡作用。2．虎杖提取物抑制增殖作用机制可能与下调Ki-67，p21ras蛋白表达，细胞周期发生G0/G1期阻滞有关。3．虎杖提取物诱导凋亡作用机制可能与下调bcl-2蛋白表达，上调Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白表达，经由细胞凋亡的死亡受体和线粒体通路完成凋亡的启动和执行。4．虎杖提取物具有显著的抗肿瘤作用，有望开发成一种新的抗肿瘤药物。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 药物与试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 实验细胞
• 2.2 方法
• 2.2.1 体外细胞培养
• 2.2.2 虎杖提取物实验分组及配制
• 2.2.3 MTT体外细胞毒活性测定
• 2.2.4 细胞形态学观察
• 2.2.5 TUNEL染色法检测细胞凋亡
• 2.2.6 流式细胞仪检测
• 2.2.7 免疫细胞化学染色
• 2.3 统计学处理
• 第三章 结果
• 3.1 MTT法检测虎杖提取物对A549人癌细胞株的抗增殖作用
• 3.2 A549人肺癌细胞株的形态学改变
• 3.3 TUNEL法检测虎杖提取物对A549细胞株的诱导凋亡作用
• 3.4 流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期改变
• 3.5 凋亡关键效应酶与凋亡相关基因蛋白表达水平的检测
• 附图
• 第四章 讨论
• 4.1 虎杖提取物对MCF-7人乳腺癌细胞株细胞周期的影响
• 4.2 虎杖提取物诱导MCF-7人乳腺癌细胞株的凋亡作用
• 4.3 虎杖提取物影响MCF-7人乳腺癌细胞株凋亡通路的机制探讨
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 综述
• 参考文献