论文摘要
研究背景淋巴瘤是原发于淋巴造血组织的免疫系统恶性肿瘤。随着AIDS、器官移植、肿瘤放化疗免疫抑制的应用等近年来发病率急剧升高。与非霍奇金淋巴瘤截然不同,霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma,HL）以其相当独特的病理特征而倍受人们关注,其恶性成分-H/RS（Hodgkin/Reed-Sternberg,H/RS）细胞只占肿瘤组织的极少部分（＜1%）,其余是大量以淋巴细胞为主的背景细胞。H/RS细胞的发生、发展机制一直悬而未决,而由于缺乏能够体现HL特殊病理学特征的动物模型,H/RS细胞与背景细胞相互关系的研究受到限制。有报道H/RS细胞的发生与CD99基因表达缺失有关;本研究组前期将慢病毒ShRNA质粒转染内源性mCD99L2（mouse CD99 antigen-like 2）基因表达阳性的鼠B淋巴瘤细胞株A20以筛选低表达mCD99L2基因的LV-mCD99L2-A20克隆株时发现其中出现类似人HL的H/RS样细胞,目前需要鉴定LV-mCD99L2-A20克隆株在反复传代过程中能否始终保持低表达mCD99L2的特性、能否始终出现类似人HL的H/RS样细胞、LV-mCD99L2-A20克隆株在生物学特性和免疫表型上与A20细胞有何差异,继而需要探讨LV-mCD99L2-A20克隆株在动物体内的成瘤特性及能否在BALB/c小鼠体内诱导出类似人HL的背景细胞等问题。目前常见的淋巴瘤模型多为用淋巴瘤细胞株或病人淋巴瘤组织种植于免疫缺陷动物体内而建立的移植性淋巴瘤模型,这些模型在研究淋巴瘤分子机制中发挥了重要作用,但淋巴瘤为免疫系统恶性肿瘤,其发生与机体免疫状况有着密切的关系,因此无论是T细胞缺陷的裸小鼠还是T、B细胞联合免疫缺陷的SCID小鼠,由于其免疫功能的缺乏,无法模拟具有免疫功能的人体内环境,难以运用此类模型去揭示淋巴瘤的发生与机体之间的相互作用及机制,更加难以运用于HL模型中背景细胞的诱导,因此在选用LV-mCD99L2-A20细胞接种动物之前,有必要对鼠B淋巴瘤细胞株A20在有免疫功能的BALB/c小鼠体内成瘤的方式进行探讨,比较不同造模方式的优劣,同时也可为B淋巴瘤相关研究提供适合的实验平台。另外,HL背景细胞的产生不仅与机体整体的免疫状况有关,也与H/RS细胞所诱导的免疫微环境有关。报道显示可能有多种细胞因子参与了H/RS细胞在体内的生存、增殖和逃避凋亡的过程,从而营造了H/RS细胞适宜的生存环境。细胞因子与HL及H/RS细胞之间的关系如何、A20与LV-mCD99L2-A20细胞在细胞因子的表达方面有无差异、在体内成瘤组织中A20与LV-mCD99L2-A20分别对细胞因子的表达产生何种影响、LV-mCD99L2-A20体内外的细胞因子表达能否有助于HL动物模型的构建等一系列问题有待解决,因此在分别构建了A20/LV-mCD99L2-A20动物模型后本研究将从细胞因子表达的角度初步探讨A20/LV-mCD99L2-A20细胞模型和动物模型与HL之间的关系。目的1、鉴定低表达mCD99L2的LV-mCD99L2-A20细胞亚系,以探究mCD99L2基因在HL的H/RS细胞形成中的作用,并为后续模型动物的构建奠定基础。2、鼠源性B淋巴瘤细胞株A20以不同方式接种同源BALB/c小鼠,构建有免疫功能的鼠B淋巴瘤动物模型,探讨不同造模方式的优劣,为本研究后续工作奠定基础,并为B淋巴瘤相关研究提供适合的实验平台。3、将LV-mCD99L2-A20细胞亚系接种BALB/c小鼠,进行成瘤情况观察、病理形态学观察、分子生物学鉴定和免疫标记的检测,探讨成瘤特点、成瘤组织病变特征与A20动物模型之间的差异及与HL之间的关系。4、借助生物信息学软件对HL与细胞因子相关性进行检索和分析。利用蛋白芯片初步检测A20/LV-mCD99L2-A20细胞和BALB/c成瘤组织中细胞因子的表达、及差异,寻找LV-mCD99L2-A20细胞模型、动物模型与构建类人HL动物模型之间关系的相关依据。方法1、LV-mCD99L2-A20细胞亚系的鉴定对前期构建的慢病毒质粒稳定干扰的LV-mCD99L2-A20克隆株进行体外培养,倒置显微镜、HE染色观察LV-mCD99L2-A20细胞的形态变化并进行计数,随机选择多代细胞进行DNA-PCR检测ShRNA干扰载体的整合,RT-PCR及荧光定量PCR检测目的基因mCD99L2的表达水平,免疫荧光观察mCD30分子标记,MTT法观察细胞体外增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期及细胞的免疫表型（CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD30）。2、五种方式构建有免疫功能A20鼠B淋巴瘤动物模型将鼠源性B细胞淋巴瘤细胞株A20经皮下接种、尾静脉注射、脾脏注射、腹腔注射于同源BALB/c小鼠和A20接种裸鼠成瘤组织移植BALB/c小鼠,观察动物成瘤时间、成瘤率、皮下肿瘤生长速度、内脏成瘤播散部位;取动物脏器行石蜡包埋、制备病理切片、HE染色观察病理学形态;运用流式细胞仪检测其瘤组织细胞悬液中CD3、CD4、CD8、CD19、CD30的表达;流式细胞仪检测正常BALB/c小鼠、接种成瘤小鼠和未成瘤小鼠外周血中淋巴细胞亚群的比例。3、LV-mCD99L2-A20鼠淋巴瘤动物模型的构建将经过鉴定的低表达mCD99L2基因的LV-mCD99L2-A20细胞亚系经皮下接种、尾静脉注射和裸鼠成瘤组织块移植的方法接种BALB/c小鼠,观察动物成瘤情况;取动物脏器行石蜡包埋、病理切片、HE染色观察病理学形态;计数成瘤切片中H/RS样细胞;免疫荧光检测瘤组织mCD30分子标记;运用流式细胞仪检测其瘤组织细胞悬液中CD3、CD4、CD8、CD19、CD30的表达。肿瘤组织进行原代培养,DNA-PCR检测载体的整合,RT-PCR检测mCD99L2基因mRNA水平。流式细胞仪检测小鼠外周血和脾脏中淋巴细胞亚群的比例。4、A20/LV-mCD99L2-A20体内外细胞因子表达蛋白芯片初步检测运用生物信息学软件GeneClip对HL和62种细胞因子进行文献检索,构建网络关系图。运用小鼠细胞因子功能分类蛋白芯片（RayBiotech mouse cytokineAntibody Arrays）对A20细胞和LV-mCD99L2-A20细胞、A20细胞BALB/c皮下成瘤组织和LV-mCD99L2-A20细胞BALB/c鼠皮下成瘤组织进行蛋白质抽提、蛋白质定量,膜封闭和孵育、62种小鼠细胞因子检测、图像采集和数据分析,对差异细胞因子进行初步分析。结果1、LV-mCD99L2-A20细胞亚系的鉴定（1）传代过程中倒置显微镜观察和HE染色均发现LV-mCD99L2-A20细胞中存在类似H/RS细胞的大细胞。随机抽取A、B、C、D代LV-mCD99L2-A20细胞计数其中的大细胞发现较A20细胞中的大细胞多,差异有显著性（P＜0.05）。（2）抽提多代LV-mCD99L2-A20细胞DNA进行PCR均能检测出ShRNA干扰载体稳定整合至A20细胞基因组。（3） RT-PCR及荧光定量PCR检测目的基因mCD99L2均较A20细胞呈低水平表达,干扰效率约为50%。（4） MTT检测发现LV-mCD99L2-A20细胞体外增殖能力较对照A20组和空载体组减慢,差异有显著性（P＜0.05）。（5）流式细胞仪检测细胞周期发现LV-mCD99L2-A20细胞S期比例与A20细胞无显著性差异（P＞0.05）,但是G2期较A20细胞长,差异有显著性（P＜0.05）。（6）免疫荧光检测LV-mCD99L2-A20细胞及其中的大细胞CD30呈阳性表达。（7） LV-mCD99L2-A20细胞的CD3表达（7.47±1.27%）较A20细胞（18.93±3.87%）降低,CD8表达（8.33±3.89%）较A20细胞（18.27±3.45%）降低,CD20表达（13.10±5.16%）较A20细胞（35.33±2.25%）降低,CD30表达（76.0±12.44%）较对照A20细胞（41.70±2.60%）升高,差异有显著性（n=3,P＜0.05）,而CD4、CD19差异不显著（P＞0.05）。空载体组与对照A20细胞CD抗原表达无显著差异（P＞0.05）。2、五种方式构建有免疫功能A20鼠B淋巴瘤动物模型（1）皮下成瘤:BALB/c小鼠皮下注射2×105组（n=7）未成瘤,2×106组（n=7）、2×107组（n=7）和裸鼠瘤组织移植BALB/c小鼠组（n=7）成瘤率皆为100%,成瘤时间分别为15.29±3.2天、7.0±0.82天、6.29±0.49天。（2）内脏成瘤:BALB/c小鼠尾静脉注射2×106组、2×107组、脾脏注射组、腹腔注射组成瘤率分别为71.4%（5/7）、100%（7/7）、71.4%（5/7）、14.3%（1/7）,成瘤时间分别为76.8±12.0天、26.1±7.99天、32.6±5.99天和27天。尾静脉成瘤部位播及肝脏、脾脏、胰腺、肾脏、食道、胃、肠、肠系膜、脑、淋巴结、骨、子宫、肌肉等多脏器和组织。（3） BALB/c鼠A20成瘤组织镜下观察:瘤细胞呈弥漫性分布,大小一致,细胞核大、圆形或不规则形,核仁明显,胞质中等量、嗜碱性,类似人弥漫大B细胞淋巴瘤。（4）流式细胞仪检测成瘤组织细胞悬液（n=8）CD3、CD4、CD8、CD19、CD30的表达阳性细胞比例分别为（%）:49.27±23.75、6.07±3.65、51.2±23.1、67.06±16.39、37.93±17.03。（5）流式细胞仪检测外周血淋巴细胞亚群:各组间CD3、CD4阳性细胞比例存在显著性差异。接种A20细胞成瘤BALB/c小鼠与正常BALB/c小鼠相比CD3（P=0.014）、CD4（P=0.009）阳性细胞比例下降,差异有显著性。接种A20细胞成瘤BALB/c小鼠与接种A20细胞未成瘤BALB/c小鼠相比CD3（P=0.004）、CD4（P=0.006）阳性细胞比例下降,差异显著。接种A20细胞未成瘤BALB/c小鼠与正常BALB/c鼠相比CD3（P=0.592）、CD4（P=0.867）、CD8（P=0.398）、CD19（P=0.510）阳性细胞比例和CD4/CD8（P=0.545）比值差异皆不显著。3、LV-mCD99L2-A20鼠淋巴瘤动物模型的构建（1） LV-mCD99L2-A20接种后成瘤情况:皮下接种2×107细胞于4只裸鼠（6个位点）,100%成瘤,平均成瘤时间为13.33±4.63天,生长速度较A20裸鼠皮下接种2×107组生长缓慢。皮下注射2×107LV-mCD99L2-A20细胞于BALB/c小鼠14只,7.3%（1/14）成瘤;成瘤时间10天。裸鼠瘤组织移植BALB/c小鼠14只,7.3%（1/14）成瘤,成瘤时间6天。BALB/c小鼠尾静脉注射组28只,三月宰杀时均未成瘤。（2）病理形态:裸鼠和BALB/c小鼠成瘤组织光镜观察瘤细胞大小不一,弥漫分布,可见散在的胞浆丰富的大细胞,呈双核、多核或不规则核,核仁大,极其类似人HL的H/RS细胞形态。BALB/c小鼠H/RS细胞周围存在一定量淋巴细胞的浸润;瘤组织流式检测CD3、CD4、CD8、CD19和CD30皆呈较高表达。（3） BALB/c小鼠瘤组织原代培养:DNA-PCR检测LV-mCD99L2干扰载体整合在细胞基因组,RT-PCR显示mCD99L2基因mRNA水平较A20细胞为低。（4）流式细胞仪检测外周血淋巴细胞亚群:各组间CD3、CD4、CD8、CD19阳性细胞比例存在显著差异。接种A20细胞未成瘤BALB/c小鼠与正常BALB/c小鼠各指标差异无显著性（P＞0.05）。接种LV-mCD99L2-A20细胞未成瘤BALB/c小鼠与正常BALB/c小鼠相比外周血CD3（P=0.014）、CD4（P=0.018）阳性细胞比例下降而CD19（P=0.012）阳性细胞比例升高,差异有显著性;而CD8（P=0.075）阳性细胞比例差异不显著。接种LV-mCD99L2-A20细胞未成瘤BALB/c小鼠与接种A20细胞未成瘤BALB/c小鼠相比CD3（P=0.004）、CD4（P=0.012）和CD8（P=0.007）阳性细胞比例下降,差异有显著性;而CD19（P=0.052）阳性细胞比例差异不显著。（5）脾脏淋巴细胞亚群:接种A20细胞未成瘤BALB/c小鼠与正常BALB/c惺笙啾菴D3（P=0.003）、CD4（P=0.007）、CD8（P=0.000）阳性细胞比例下降,CD19（P=0.004）阳性细胞比例和CD4/CD8（P=0.000）比值升高,差异有显著性。接种LV-mCD99L2-A20细胞未成瘤BALB/c小鼠与正常BALB/c小鼠相比CD3（P=0.000）、CD4（P=0.001）、CD8（P=0.000）阳性细胞比例下降而CD19（P=0.000）阳性细胞比例和CD4/CD8（P=0.000）比值升高,差异有显著性。接种LV-mCD99L2-A20细胞未成瘤BALB/c小鼠与接种A20细胞未成瘤BALB/c小鼠相比CD3（P=0.009）、CD4（P=0.020）阳性细胞比例下降,CD19（P=0.020）阳性细胞比例升高,差异有显著性;CD8（P=0.170）阳性细胞比例和CD4/CD8（P=0.646）比值无显著性差异。4、A20/LV-mCD99L2-A20细胞和组织细胞因子表达的蛋白芯片初步检测（1） LV-mCD99L2-A20细胞较A20细胞上调（≥1.5倍）的细胞因子有CD30T、IL-12p40/p70、IL-3、IFNγ、CXCL16、MIP-1α、CD40,其中CD30T表达上调2.91倍。未见表达下调超过1.5倍的细胞因子表达。（2）LV-mCD99L2-A20细胞BALB/c小鼠成瘤组织较LV-mCD99L2-A20细胞上调≥1.5倍的细胞因子主要有VCAM-1、MIP-1γ、MIG、IL-10、RANTES、PF-4、CXCL16、VEGF、MIP-3α、P-Selectin,其中VCAM-1、MIP-1γ、MIG、IL-10上调≥2倍;下调≥1.5倍的细胞因子主要有IL-6、Eotaxin、TNFα、TIMP-1、SCF、IFNγ、IL-3、CD30T、IL-5、IGFBP-6、TECK、L-Selectin、Fas Ligand、IL-3 Rb、IL-9,其中IL-6下调3倍以上。（3）LV-mCD99L2-A20细胞接种BALB/c小鼠成瘤组织较A20细胞接种BALB/c小鼠成瘤组织中下调（≥1.5倍）的细胞因子如Eotaxin、IGFBP-6、IL-12 p40/p70、IGFBP-5、MIP-1α、KC、CXCL16,其中Eotaxin、IGFBP-6下调超过2倍;而上调（≥1.5倍）的细胞因子仅是VEGF。结论1、LV-mCD99L2-A20细胞亚系中存在类似人H/RS细胞形态的H/RS样细胞,LV-mCD99L2-A20细胞在增殖能力、细胞周期和免疫表型方面较类似人HL。2、A20细胞BALB/c小鼠皮下移植瘤模型成瘤时间短、尾静脉接种式成的血行播散性模型成瘤部位广泛,均为研究有免疫功能鼠B淋巴瘤适宜的实验动物模型。3、LV-mCD99L2-A20细胞较A20细胞在BALB/c鼠难以成瘤,但在成瘤组织中出现似人HL的H/RS样细胞,伴有一定程度的背景淋巴细胞的浸润。4、LV-mCD99L2-A20细胞较A20细胞上调了一些与报道中的HL或H/RS细胞相关的细胞因子;LV-mCD99L2-A20细胞与A20细胞在BALB/c小鼠体内成瘤组织中细胞因子表达不同。创新之处本研究从体外实验、裸鼠成瘤实验和BALB/c鼠成瘤实验三个水平,从形态学、免疫表型、生物学行为三个主要方面并结合小鼠免疫功能初步检测和细胞因子表达蛋白芯片初步检测,较为系统地对比了A20细胞与LV-mCD99L2-A20细胞在细胞模型之间、动物模型之间的差异,揭示了mCD99L2基因低表达对体外、体内诱导H/RS样细胞具有重要作用;提示了LV-mCD99L2-A20 BALB/c鼠模型在出现H/RS样细胞的同时其良好的预后可能与HL具有某种相似性;结合体内外细胞因子表达的差异分析了LV-mCD99L2-A20细胞模型、动物模型与构建HL之间的相关性,为探索性的研究,为构建稳定的HL动物模型奠定了坚实的基础。
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