IMS-PCR检测食品中的单增李斯特菌

IMS-PCR检测食品中的单增李斯特菌

论文摘要

单增李斯特菌是自然界中一种常见的致病菌,能感染人类和动物;李斯特菌病是具有高致死率的一种疾病。因此,采用科学的方法检测食品中是否含有单增李斯特菌就显得非常重要。本文利用IMS-PCR法能快速、简便地从食品中检测出单增李斯特菌。免疫磁珠法(Immunomagnetic Separation简称IMS法或Listertest法)是利用抗原抗体反应的原理,做单增李斯特菌的特异性和敏感性实验;PCR(Polymerase Chain Reaction)法是针对单增李斯特菌的iap基因(编码p60蛋白)设计特异性引物,进行PCR扩增反应;做单增李斯特菌的特异性和敏感性实验。通过对这两种方法的分析和比较,建立IMS-PCR法,利用PCR法的引物,做单增李斯特菌的特异性和敏感性实验。同时,国标法(检测的标准方法)和实时荧光定量PCR法(试剂盒)作为IMS-PCR法的对照,同IMS-PCR法实验结果进行分析和比较。IMS法:能快速捕集细菌,在培养液中进行增菌(37℃14~18h);通过溶血反应和鼠李糖反应确认是否为单增李斯特菌,需要3~7天,敏感性能达到10-7。PCR法:从食品中获取单增李斯特菌到进行增菌培养要3~5天,提取细菌基因组DNA,并对其进行了PCR扩增,结果得到片段的长度为230bp,需要4h就得出结果,敏感性能达到10-5。IMS-PCR法:从快速捕集细菌到进行增菌培养,再经PCR扩增后得到片段长度为230bp;只需在1天内就能检测出单增李斯特菌,缩短了检测的时间;同时提高单增李斯特菌检测的特异性和敏感性。IMS-PCR法的实验结果与国标法和实时荧光定量PCR法(试剂盒)法的结果相符,然而它比国标法简便、快速、灵敏度高,比实时定量PCR(试剂盒)法价格低;因此从经济和实用性上,IMS-PCR法有很好的应用前景和研究价值。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 单增李斯特菌
  • 1.1.1 简介
  • 1.1.2 生物学特性
  • 1.1.2.1 形态特征
  • 1.1.2.2 培养和生化特性
  • 1.2 亚分型
  • 1.2.1 LM 的传统表型亚分型法
  • 1.2.1.1 血清分型
  • 1.2.1.2 噬菌体分型
  • 1.2.1.3 多区带酶电泳分型
  • 1.2.2 LM 的遗传亚分型
  • 1.2.2.1 核糖体分型
  • 1.2.2.2 以 DNA 序列为基础的亚分型
  • 1.3 毒力及对理化因素的抵抗力
  • 1.3.1 毒力
  • 1.3.1.1 李斯特菌溶解素
  • 1.3.1.2 ActA 蛋白
  • 1.3.1.3 磷脂酶 C
  • 1.3.1.4 P60 蛋白
  • 1.3.1.5 Prf 蛋白
  • 1.3.1.6 内化素
  • 1.3.1.7 表面蛋白 P104
  • 1.3.2 对理化因素的抵抗力
  • 1.4 流行病学
  • 1.4.1 自然界分布
  • 1.4.2 食品污染
  • 1.4.3 易感人群
  • 1.5 临床表现
  • 1.6 LM 的检测
  • 1.6.1 传统分离培养检测及鉴定方法
  • 1.6.2 显色培养基快速鉴定技术
  • 1.6.3 数值分类鉴定和新型计数技术
  • 1.6.4 免疫检测技术
  • 1.6.5 分子检测技术
  • 1.6.5.1 探针检测技术
  • 1.6.5.2 PCR 检测技术
  • 1.6.5.3 免疫-PCR 检测技术
  • 1.6.6 现阶段检测单增李斯特菌存在的问题
  • 1.6.7 展望
  • 1.7 本文的研究内容
  • 第二章 材料和方法
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 菌株
  • 2.1.2 仪器与试剂
  • 2.1.2.1 仪器
  • 2.1.2.2 试剂
  • 2.1.2.3 配制试剂
  • 2.2 方法步骤
  • 2.2.1 国标法
  • 2.2.1.1 国标法流程
  • 2.2.1.2 步骤
  • 2.2.2 免疫磁株法
  • 2.2.2.1 原理
  • 2.2.2.2 步骤
  • 2.2.3 PCR 法
  • 2.2.3.1 引物设计
  • 2.2.3.2 菌落稀释
  • 2.2.3.3 单增李斯特菌 DNA 模板的制备
  • 2.2.3.4 PCR 扩增
  • 2.2.3.5 PCR 结果的电泳检测
  • 2.2.3.6 实验步骤
  • 2.2.4 IMS-PCR 法
  • 2.2.4.1 单增李斯特菌 IMS-PCR 法的特异性
  • 2.2.4.2 单增李斯特菌 IMS-PCR 法的敏感性
  • 2.2.5 RealTime PCR 法
  • 2.2.5.0 简介
  • 2.2.5.1 实验方法
  • 2.2.5.2 实验步骤
  • 第三章 结果与分析
  • 3.1 实验结果
  • 3.1.1 国标法实验结果
  • 3.1.1.1 培养特性
  • 3.1.1.2 生化反应
  • 3.1.1.3 国标法分析
  • 3.1.2 菌落计数
  • 3.1.3 免疫磁株法实验结果
  • 3.1.3.1 特异性实验
  • 3.1.3.2 灵敏度实验
  • 3.1.3.3 抗干扰实验
  • 3.1.4 PCR 法实验结果
  • 3.1.4.1 单增李斯特菌 DNA 模板的制备
  • 3.1.4.2 单增李斯特菌 PCR 法的特异性实验
  • 3.1.4.3 单增李斯特菌 PCR 法的敏感性实验
  • 3.1.5 IMS-PCR 法实验结果
  • 3.1.5.1 单增李斯特菌 IMS-PCR 法的特异性
  • 3.1.5.2 单增李斯特菌 IMS-PCR 法的敏感性
  • 3.1.6 RealTime PCR 法实验结果
  • 3.1.6.1 单增李斯特菌 RealTime PCR 法的特异性
  • 3.1.6.2 单增李斯特菌 RealTime PCR 法的敏感性
  • 3.1.6.3 图片分析
  • 3.2 实验分析
  • 3.2.1 IMS 法
  • 3.2.1.1 简便快速是 IMS 法检测李斯特菌的最大优势
  • 3.2.1.2 敏感性好
  • 3.2.1.3 实验方法可以灵活掌握
  • 3.2.1.4 IMS 法的缺点
  • 3.2.2 PCR 法
  • 3.2.2.1 普通 PCR 法
  • 3.2.2.2 RealTime PCR 法
  • 3.2.2.3 两种方法的比较
  • 3.2.3 IMS-PCR 方法
  • 3.2.4 展望
  • 第四章 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 相关论文文献

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