IMS-PCR检测食品中的单增李斯特菌

论文摘要

单增李斯特菌是自然界中一种常见的致病菌，能感染人类和动物；李斯特菌病是具有高致死率的一种疾病。因此，采用科学的方法检测食品中是否含有单增李斯特菌就显得非常重要。本文利用IMS-PCR法能快速、简便地从食品中检测出单增李斯特菌。免疫磁珠法（Immunomagnetic Separation简称IMS法或Listertest法）是利用抗原抗体反应的原理，做单增李斯特菌的特异性和敏感性实验；PCR（Polymerase Chain Reaction）法是针对单增李斯特菌的iap基因（编码p60蛋白）设计特异性引物，进行PCR扩增反应；做单增李斯特菌的特异性和敏感性实验。通过对这两种方法的分析和比较，建立IMS-PCR法，利用PCR法的引物，做单增李斯特菌的特异性和敏感性实验。同时，国标法（检测的标准方法）和实时荧光定量PCR法（试剂盒）作为IMS-PCR法的对照,同IMS-PCR法实验结果进行分析和比较。IMS法：能快速捕集细菌，在培养液中进行增菌（37℃14～18h）；通过溶血反应和鼠李糖反应确认是否为单增李斯特菌，需要3～7天，敏感性能达到10-7。PCR法：从食品中获取单增李斯特菌到进行增菌培养要3～5天，提取细菌基因组DNA，并对其进行了PCR扩增，结果得到片段的长度为230bp，需要4h就得出结果，敏感性能达到10-5。IMS-PCR法：从快速捕集细菌到进行增菌培养，再经PCR扩增后得到片段长度为230bp；只需在1天内就能检测出单增李斯特菌，缩短了检测的时间；同时提高单增李斯特菌检测的特异性和敏感性。IMS-PCR法的实验结果与国标法和实时荧光定量PCR法（试剂盒）法的结果相符，然而它比国标法简便、快速、灵敏度高，比实时定量PCR（试剂盒）法价格低；因此从经济和实用性上，IMS-PCR法有很好的应用前景和研究价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 单增李斯特菌
• 1.1.1 简介
• 1.1.2 生物学特性
• 1.1.2.1 形态特征
• 1.1.2.2 培养和生化特性
• 1.2 亚分型
• 1.2.1 LM 的传统表型亚分型法
• 1.2.1.1 血清分型
• 1.2.1.2 噬菌体分型
• 1.2.1.3 多区带酶电泳分型
• 1.2.2 LM 的遗传亚分型
• 1.2.2.1 核糖体分型
• 1.2.2.2 以 DNA 序列为基础的亚分型
• 1.3 毒力及对理化因素的抵抗力
• 1.3.1 毒力
• 1.3.1.1 李斯特菌溶解素
• 1.3.1.2 ActA 蛋白
• 1.3.1.3 磷脂酶 C
• 1.3.1.4 P60 蛋白
• 1.3.1.5 Prf 蛋白
• 1.3.1.6 内化素
• 1.3.1.7 表面蛋白 P104
• 1.3.2 对理化因素的抵抗力
• 1.4 流行病学
• 1.4.1 自然界分布
• 1.4.2 食品污染
• 1.4.3 易感人群
• 1.5 临床表现
• 1.6 LM 的检测
• 1.6.1 传统分离培养检测及鉴定方法
• 1.6.2 显色培养基快速鉴定技术
• 1.6.3 数值分类鉴定和新型计数技术
• 1.6.4 免疫检测技术
• 1.6.5 分子检测技术
• 1.6.5.1 探针检测技术
• 1.6.5.2 PCR 检测技术
• 1.6.5.3 免疫-PCR 检测技术
• 1.6.6 现阶段检测单增李斯特菌存在的问题
• 1.6.7 展望
• 1.7 本文的研究内容
• 第二章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 仪器与试剂
• 2.1.2.1 仪器
• 2.1.2.2 试剂
• 2.1.2.3 配制试剂
• 2.2 方法步骤
• 2.2.1 国标法
• 2.2.1.1 国标法流程
• 2.2.1.2 步骤
• 2.2.2 免疫磁株法
• 2.2.2.1 原理
• 2.2.2.2 步骤
• 2.2.3 PCR 法
• 2.2.3.1 引物设计
• 2.2.3.2 菌落稀释
• 2.2.3.3 单增李斯特菌 DNA 模板的制备
• 2.2.3.4 PCR 扩增
• 2.2.3.5 PCR 结果的电泳检测
• 2.2.3.6 实验步骤
• 2.2.4 IMS-PCR 法
• 2.2.4.1 单增李斯特菌 IMS-PCR 法的特异性
• 2.2.4.2 单增李斯特菌 IMS-PCR 法的敏感性
• 2.2.5 RealTime PCR 法
• 2.2.5.0 简介
• 2.2.5.1 实验方法
• 2.2.5.2 实验步骤
• 第三章 结果与分析
• 3.1 实验结果
• 3.1.1 国标法实验结果
• 3.1.1.1 培养特性
• 3.1.1.2 生化反应
• 3.1.1.3 国标法分析
• 3.1.2 菌落计数
• 3.1.3 免疫磁株法实验结果
• 3.1.3.1 特异性实验
• 3.1.3.2 灵敏度实验
• 3.1.3.3 抗干扰实验
• 3.1.4 PCR 法实验结果
• 3.1.4.1 单增李斯特菌 DNA 模板的制备
• 3.1.4.2 单增李斯特菌 PCR 法的特异性实验
• 3.1.4.3 单增李斯特菌 PCR 法的敏感性实验
• 3.1.5 IMS-PCR 法实验结果
• 3.1.5.1 单增李斯特菌 IMS-PCR 法的特异性
• 3.1.5.2 单增李斯特菌 IMS-PCR 法的敏感性
• 3.1.6 RealTime PCR 法实验结果
• 3.1.6.1 单增李斯特菌 RealTime PCR 法的特异性
• 3.1.6.2 单增李斯特菌 RealTime PCR 法的敏感性
• 3.1.6.3 图片分析
• 3.2 实验分析
• 3.2.1 IMS 法
• 3.2.1.1 简便快速是 IMS 法检测李斯特菌的最大优势
• 3.2.1.2 敏感性好
• 3.2.1.3 实验方法可以灵活掌握
• 3.2.1.4 IMS 法的缺点
• 3.2.2 PCR 法
• 3.2.2.1 普通 PCR 法
• 3.2.2.2 RealTime PCR 法
• 3.2.2.3 两种方法的比较
• 3.2.3 IMS-PCR 方法
• 3.2.4 展望
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢