论文摘要
近几年随着农业废物数量日益增长,堆肥技术作为一项经济有效的农业废物处理与资源化利用技术备受关注。而难降解的木质素是农业废物堆肥化过程中的主要限速有机物,其降解被认为是快速堆肥的关键。黄孢原毛平革菌由于其具有对木质素独特出色的分解转化能力而成为研究木质素降解的模式生物,而其对木质素的降解主要依赖于它代谢过程中分泌的相关胞外酶的作用。木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）是黄孢原毛平革菌次级代谢过程中产生的,是被国内外学者重点关注的两种木质素降解功能酶,它们可催化木质素及其他芳香族化合物等限速有机物的降解,是关系着堆肥进程的关键功能酶。由于木质素降解功能酶作用底物所处环境的复杂性,木质素的酶解过程会受到各种外在因素的影响。因此,深入探究农业废物中木质素酶解影响因素及其机理对于促进木质素高效降解和推动堆肥技术的快速发展具有重要的理论价值与现实意义。目前主要是利用非纯化且酶活较低的粗酶来降解木质素以及进行木质素酶解作用机理的研究,导致木质素的降解效率较低且难以明确木质素酶解作用机理。为获得高效木质素酶解效果以及完善木质素降解功能酶的作用机理,开发新的分离纯化技术获得纯木质素降解功能酶及完善功能酶的酶学性质研究颇有意义。本文模拟了木质素降解功能酶在不同堆肥基质（土壤、菜叶、稻草和麸皮）中的吸附传输行为,考察了活性介体物质对木质素酶解过程的影响,探究了重金属对黄孢原毛平革菌的毒害作用以及黄孢原毛平革菌的生长代谢、木质素酶解途径对重金属污染胁迫的响应机制,并开发新纯化技术从黄孢原毛平革菌的发酵液中同时分离纯化出LiP和MnP以及对纯化的木质素降解功能酶的酶学特性进行初探。本文的具体研究工作和成果包括以下4个部分内容:第1部分为木质素降解功能酶在堆肥基质中吸附传输性能的研究。（1）ESEM分析可知,4种堆肥基质（土壤、菜叶、稻草和麸皮）在与酶液接触的过程中对木质素降解功能酶发生了吸附行为,LiP和MnP通过某种吸附方式附着在基质表面或者渗透至其内部。红外光谱进一步证实了基质在对酶的吸附行为中包含各种各样的化学吸附方式,包括疏水基团之间的有效结合,羰基、羧基等有机基团之间的键合,以及羰基与金属键之间的单齿螯合等等。（2）堆肥基质对LiP吸附能力的排列顺序是:菜叶>土壤>稻草>麸皮,对MnP吸附能力的排列顺序是:土壤>菜叶>稻草>麸皮。当MnP/LiP酶活比变化时,各基质对两种酶的吸附量都有所改变,但变化幅度均较小。MnP和LiP之间存在竞争吸附。（3）MnP和LiP在稻草和麸皮基质柱中的传输性能要优于它们在土壤和菜叶基质柱中的传输性能,这与基质的物化性质和组成有关,其中基质的真密度和有机质含量对传输的影响占主导地位。真密度大小在一定程度上决定了比表面积的大小,从而控制了有效吸附位点的数目。有机质中含有大量的吸附活性官能团,如亚甲基、烷烃、羰基和氨基等可增加基质与酶相应基团之间的键合作用,基质表面的憎水性基团与酶分子表面的憎水部位接触形成稳定配合物,均对吸附产生正效应,限制酶向基质更深层传输。MnP/LiP酶活比变化对木质素降解功能酶在堆肥基质中的传输也有一定的影响,且对LiP和MnP传输的影响效果有所差别。第2部分为活性介体物质对木质素酶解的影响研究。在木质素降解功能酶-介体物质-稻草固态发酵体系中,各实验组中样品总干重、有机质含量以及木质素降解率的变化情况均表明介体物质(草酸、藜芦醇和Mn2+)对木质素的酶解作用有一定的促进作用。其中藜芦醇主要是参与LiP对木质素的催化降解,作用机制可能是其作为氧化还原介体参与木质素降解,或保护LiP,或抑制还原复合物Ⅱ生成原酶。草酸和Mn2+参与MnP对木质素的催化降解,草酸可作为螯合剂形成稳定的Mn3+复合物,而Mn2+可提高MnP合成和活性。介体物质的种类和浓度会对木质素降解产生不同的影响,优化的介体物质的种类和浓度配比为:藜芦醇0.12mMg-1（稻草干重）,草酸0.06mMg-1（稻草干重）,Mn2+0.012mMg-1（稻草干重）。第3部分为重金属对黄孢原毛平革菌生长代谢的毒害作用以及黄孢原毛平革菌产木质素降解功能酶、木质素酶解途径对重金属污染胁迫的应答行为研究。（1）研究了镉（Cd）、铅（Pb）单一污染及其复合污染对黄孢原毛平革菌在平板中的生长影响。Cd单一污染胁迫下,低浓度Cd污染胁迫对菌落直径、菌丝体干重以及气生菌丝的生长势具有刺激作用。Pb单一污染胁迫下,当Pb浓度在25100mgL-1范围内时,菌落直径、菌丝体干重以及气生菌丝的生长势均随着Pb浓度的增大而增强或增大。Cd和Pb复合污染胁迫下,低浓度会增强气生菌丝生长势和增大菌落直径,但实验设定的任一浓度下都会降低菌丝体干重。黄孢原毛平革菌对Cd和Pb均具有生物富集作用,这种富集作用同时受基底重金属浓度和真菌生长量的影响。Cd和Pb复合污染胁迫会增加黄孢原毛平革菌对Pb的吸收,抑制其对Cd的吸收。（2）研究了Cd、Pb单一污染及其复合污染对黄孢原毛平革菌在液态培养中的生长影响。Cd、Pb单一污染及其复合污染胁迫下黄孢原毛平革菌的生长均受到了抑制,且随着Cd或Pb浓度的增加这种抑制作用增强。Cd比Pb对黄孢原毛平革菌的毒性作用更大,极低浓度的Cd就会很大程度的减少黄孢原毛平革菌的生物量。Cd和Pb复合污染由于它们的协同作用会加剧对黄孢原毛平革菌的毒性,微生物量急剧减少。Cd、Pb及其复合污染还可能通过改变黄孢原毛平革菌的代谢环境而影响其产木质素降解功能酶的能力。黄孢原毛平革菌对Cd和Pb均具有吸附去除作用。（3）研究了白腐菌应用于稻草固态发酵中,Cd或Pb对白腐菌生长代谢活动的影响、白腐菌降解木质纤维素能力和木质素酶解途径对Cd或Pb污染胁迫的应答行为以及白腐菌对Cd或Pb清除能力和机理:Cd会抑制白腐菌的生长繁殖,并随着Cd浓度的增加其毒害作用增强。低浓度Pb（25mgL-1）对白腐菌的生长的影响呈现出低浓度刺激生长现象。Cd污染胁迫对白腐菌产LiP和MnP的能力有很大的限制作用。白腐菌对Pb具有一定的耐受性,低浓度的Pb对白腐菌产木质素降解功能酶有一定的促进作用,只有当Pb浓度较高时才转变为抑制作用。重金属具有很强的氧化性能,是氧供体的一种强竞争离子,在白腐菌体内能诱发产生羟基自由基（HO·）、超氧阴离子自由基（O2?-）和过氧化氢（H2O2）等活性自由基（ROS）。低浓度的Cd对白腐菌产草酸的影响很小,而高浓度的Cd会促进白腐菌产草酸。实验设定的所有初始浓度Pb对白腐菌产草酸都表现为促进作用;Cd降低黄孢原毛平革菌产LiP和MnP能力的同时会抑制木质素降解功能酶对S、G型木质素或纤维素结构的断裂,从而限制木质素有效降解。2mgL-1的Cd污染会促进纤维素和半纤维的降解,而高浓度Cd会抑制了纤维素C-H键的断裂。白腐菌对Pb具有一定耐受性,适宜浓度的Pb由于增加了MnP的酶活性,可促进黄孢原毛平革菌降解难降解的木质素产生简单的芳香族醚和脂肪族化合物等,但Pb的存在会抑制纤维素的降解;黄孢原毛平革菌在降解木质纤维素的同时,通过菌体表面物理化学吸附重金属、菌代谢物的络合作用和胞内积累重金属以及腐殖质对重金属的强络合作用清除了大量的水溶-可交换态Cd或Pb,重金属与微生物之间存在着双向影响作用。第4部分为从黄孢原毛平革菌发酵液中分离纯化LiP和MnP及其酶学特性的研究。（1）超滤、阴离子交换层析和凝胶层析组合而成的纯化技术可从黄孢原毛平革菌发酵液中分别提纯MnP和LiP,此方法能获得较高纯度的MnP和LiP,且快速、简单、重现性好。（2）纯化的MnP和LiP的相对分子量分别为45和36kDa。LiP的N端氨基酸序列是VACPDGVHVPTNACC,MnP的N端氨基酸序列是AVCPDGTRVTNAACC。（3）纯化的LiP和MnP的最适宜pH值分别是3.0和4.5,MnP在pH3.54.5范围内,其剩余酶活仍保持在95%98%,比LiP的适宜pH范围略广。纯化的MnP和LiP的最适宜温度都是30°C,属于较温和热稳定性的酶种。Mn2+、Ca2+、Cu2+、低浓度的Co2+和高浓度的K+对MnP酶活性有促进作用,Ca2+、Na+、Co2+、和低浓度的Cu2+、Zn2+对LiP酶活性表现为促进作用。（4）纯化的MnP和LiP对基质没有特异性,但对不同基质催化效力存在差别。Mn2+是MnP的最适底物,MnP对其的催化速率最高,而LiP对藜芦醇的亲和力最强。提高纯度的LiP和MnP可促进其对基质的酶促反应,可促进其对天然木质素的酶解效率。本论文研究揭示了农业废物稻草中木质素的酶解影响因素及其机理,并分离纯化了木质素降解功能酶及探究了这两功能酶的生物化学特性,可为进一步完善木质素酶解机理的研究奠定基础,并为促进木质素高效降解和推动堆肥技术快速发展提供理论依据和技术支持。
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标签：农业废物论文; 木质素论文; 堆肥论文; 降解功能酶论文; 吸附传输论文; 活性介体论文; 重金属胁迫论文; 分离纯化论文;