论文摘要
第一部分肾上腺髓质素在肾肿瘤组织中的表达和其与肿瘤组织微血管密度关系的研究目的:应用免疫组织化学方法、流式细胞学方法观察检测肾细胞癌组织、正常肾组织中肾上腺髓质素（Adrenomedullin ,ADM）的表达情况,并检测肾肿瘤组织和正常肾组织微血管密度（Microvessel density, MVD）,旨在探讨ADM在肾细胞癌发生发展中的作用,及其肾肿瘤血管生成作用,为研究肾细胞癌侵袭转移、预后判断以及分子生物学分期提供一个分子生物学指标,并为肾细胞癌的综合治疗,尤其是基因靶向治疗提供理论依据。方法:收集资料完整的肾细胞癌病例33例,标本离体后均在无菌条件下立即取材,每一例标本包括癌组织、距肿瘤边缘2cm以上正常肾实质组织。分别应用免疫组织化学染色和流式细胞学方法检测肾肿瘤组织和正常肾组织中ADM和肾上腺髓质素受体（Adrenomedullin receptor,ADMR）的表达和两组组织MVD,并分析ADM和ADMR在组织中表达与MVD的相关性。结果:免疫组织化学检测ADM在肾细胞癌组织中表达阳性率为100%,而在正常肾组织中表达阳性率仅9.1%,且表达弱阳性;流式细胞学方法检测肾细胞癌组织中ADM表达水平为1267.84±127.52,正常肾组织中ADM表达水平为970.36±0171.46,P=0.000<0.05,ADM在肾细胞癌组织中表达水平明显高于其在正常肾组织中表达水平。肾细胞癌组织ADMR表达水平1161.91±202.71 ,正常肾组织ADMR表达水平826.05±171.99,P=0.000<0.05,ADMR在肾细胞癌组织中表达水平明显高于其在正常肾组织中表达水平。与组织MVD相关性分析发现ADM和ADMR在肾细胞癌组织中表达与组织微血管密度呈正相关性。结论: ADM和ADMR在肾细胞癌组织中表达明显高于其在正常肾组织中表达,并且ADM和ADMR在肾细胞癌组织中高表达与肿瘤组织MVD呈正相关性,表明ADM在肾肿瘤新生血管生成方面起到一定促进作用,ADM可能成为肾肿瘤靶向治疗新的靶点。第二部分低氧刺激诱导ADM在肾肿瘤细胞的表达及ADM对VEGF在肾肿瘤细胞表达的影响目的:探讨低氧刺激诱导ADM在肾肿瘤细胞中表达的影响,并研究ADM对VEGF在肾肿瘤细胞中表达的影响,进一步探讨ADM在肾肿瘤新生血管生成方面的作用。方法:在低氧分压（5% CO2,94.55% N2,0.45% O2 ,37C0）状态和正常氧分压（20% O2 5% CO2,37C0）状态下培养人肾肿瘤细胞786-o,Western blot和RT-PCR检测ADM在肾肿瘤细胞中表达;在正常氧分压状态下培养人肾肿瘤细胞786-o,分别加入外源性ADM和ADM+ADM受体抑制剂,Western boltting和RT-PCR检测VEGF在肾肿瘤细胞中表达。结果:1低氧刺激可诱导ADM在肾肿瘤细胞中表达升高。低氧培养肾肿瘤细胞3小时,western blot检测ADM在肾肿瘤细胞中表达明显高于对照组,t=-8.603 p=0.000<0.05; RT-PCR检测ADM mRNA在肾肿瘤细胞中表达明显高于对照组,t=-13.277 P=0.000<0.05;并且随低氧刺激时间延长,ADM和ADMmRNA在肾肿瘤细胞中表达将进一步升高。2ADM对VEGF在肾肿瘤细胞中表达的影响。Western blot检测VEGF在ADM处理组肾肿瘤细胞中表达明显高于其在对照组的表达（24h组t=-3.069 P=0.007<0.05;48h组t=-18.692 P=0.000<0.05;72h组t=-35.184 P=0.000<0.05）;VEGF在ADM+ADM受体抑制剂组肾肿瘤细胞中表达与其在对照组表达无区别（24h组t=0.922 P=0.369>0.05;48h组t=0.043 P=0.966>0.05 ;72h组t=-0.372 P=0.714>0.05）。RT-PCR检测VEGF mRNA在肾肿瘤细胞中表达,结果显示VEGFmRNA在ADM处理组肾肿瘤细胞中表达高于其在对照组的表达（24h组t=-2.910 P=0.009<0.05 ; 48h组t=-19.006 P=0.000<0.05 ; 72h组t=-30.973 P=0.000<0.05 ）;VEGFmRNA在ADM+ADM受体抑制剂组肾肿瘤细胞中表达与其在对照组的表达无区别（ 24h组t=-0.597 P=0.558>0.05 ; 48h组t=0.605 P=0.553>0.05 ; 72h组t=-0.620 P=0.543>0.05）。结论:低氧刺激可诱导ADM在人肾肿瘤细胞中表达升高,并且随低氧刺激时间的延长ADM的表达将进一步升高。ADM可诱导VEGF在肾肿瘤细胞中表达升高。ADM受体抑制剂可有效阻断ADM诱导VEGF在肾肿瘤细胞中表达升高的作用。ADM可能通过诱导VEGF表达升高,参与肾肿瘤新生血管生成的调节作用。第三部分ADM在肾肿瘤血管生成信号转导通路的研究目的:磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol-3 kinase ,PI3K）/蛋白激酶B（ Protein kinase B ,Akt or PKB）通路具有调节细胞生长,增殖,血管生成和提高细胞耐受低氧或营养缺乏的作用。本部分通过研究ADM对肾肿瘤细胞内PI3K /Akt通路的激活作用和对内皮一氧化氮合酶（Nitricoxide synthase ,eNOS）表达的影响,进一步探讨ADM对肾肿瘤血管生成及肿瘤进展方面的作用。方法:将人肾肿瘤786-o细胞分为对照组,ADM刺激组,VEGF刺激组,ADM+VEGF受体抑制剂刺激组,ADM+ADM受体抑制剂刺激组,每组又设24小时,48小时,72小时三个时间组。westen-blot检测各组细胞总蛋白中PI3K、Akt、eNOS的表达水平。结果:ADM处理组、VEGF处理组、ADM+VEGF受体抑制剂处理组与对照组相比PI3K/Akt和eNOS表达均高与对照组（PI3K表达: ADM组:对照组t=-7.555 P=0.000<0.05 ; VEGF组:对照组t=-3.03 P=0.007<0.05 ; ADM+VEGF受体抑制剂组:对照组t=-3.832 P=0.001<0.05;Akt表达:ADM组:对照组t=-3.339 P=0.004<0.05;VEGF组:对照组t=-3.805 P=0.001<0.05; ADM+VEGF受体抑制剂组:对照组t=-3.519 P=0.003<0.05;eNOS表达: ADM组:对照组t=-13.443 P=0.000<0.05;VEGF组:对照组t=-12.607 P=0.007<0.05;ADM+VEGF受体抑制剂组:对照组t=-13.088 P=0.001<0.05）,具有统计学意义,并且随作用时间延长,PI3K/Akt和eNOS表达将进一步升高。但ADM处理组和ADM+VEGF受体抑制剂处理组相比,PI3K/Akt和eNOS在细胞内表达无区别（PI3K表达ADM组:ADM+VEGF受体抑制剂组24h组t=0.726,P=0.477>0.05; 48h组t=0.199 ,P=0.844>0.05; 72h组t=0.171,P=0.866>0.05。Akt表达ADM组:ADM+VEGF受体抑制剂组24h组t=0.501 P=0.624>0.05; 48h组t=1.03 P=0.317>0.05; 72h组t=0.946 P=0.357>0.05。eNOS表达ADM组:ADM+VEGF受体抑制剂组24h组t=-0.017 P=0.987>0.05; 48h组t=0.430 P=0.672>0.05; 72h组t=-0.370 P=0.715>0.05）。ADM组PI3K/Akt和eNOS在细胞内表达明显高于加入ADM受体抑制剂组（PI3K表达ADM组:ADM+ADM受体抑制剂组24h组t=3.456 P=0.003<0.05 ; 48h组t=6.960 P=0.000<0.05;72h组t=10.397 P=0.000<0.05。Akt表达ADM组:ADM+ADM受体抑制剂组24h组t=2.629 P=0.017<0.05;48h组t=7.286 P=0.000<0.05;72h组t=11.166 P=0.000<0.05。eNOS表达ADM组:ADM+ADM受体抑制剂组24h组t=4.685 P=0.000<0.05;48h组t=6.960 P=0.000<0.05;72h组t=19.297 P=0.000<0.05）,均具有统计学意义。而ADM+ADM受体抑制剂组PI3K/Akt和eNOS在细胞内表达与对照组无区别（PI3K表达ADM+ADM受体抑制剂组:对照组24h组t=1.011 P=0.325>0.05;48h组t=-0.335 P=0.741>0.05;72h组t= 0.031 P=0.975>0.05。Akt表达ADM+ADM受体抑制剂组:对照组24h组t=-0.353 P=0.728>0.05;48h组t=-0.44 P=0.665>0.05;72h组t=-0.139 P=0.891 >0.05。eNOS表达ADM+ADM受体抑制剂组:对照组24h组t=-0.582 P=0.568>0.05;48h组t=-0.651 P=0.741>0.05;72h组t=-0.528 P=0.523>0.05）,无统计学意义。结论:ADM和VEGF均可激活肾肿瘤细胞PI3K/Akt信号转导通路并诱导eNOS在肿瘤细胞中表达升高。VEGF受体抑制剂不能阻断ADM激活PI3K/Akt信号通路并诱导eNOS表达升高的作用,说明ADM不仅仅经调节VEGF表达间接激活PI3K/Akt信号通路并诱导eNOS表达升高。ADM受体抑制剂可有效阻断ADM激活PI3K/Akt信号通路并诱导eNOS表达升高的作用。ADM经自分泌/旁分泌机制激活PI3K/Akt信号传导通路并诱导eNOS表达升高,发挥调节肿瘤血管生成的作用。
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