1α，25-（OH）2D3对破骨细胞生成和活力的影响

论文摘要

骨组织不断更新,保持生命活力主要依靠骨代谢平衡,此平衡一旦被打破即可导致各种代谢性骨病。动物骨营养不良性疾病主要是由于破骨细胞（osteoclasts,OC）引起的骨吸收大于成骨细胞（osteoblasts,OB）引起的骨生成而引起。其中,OC的形成及吸收活性主要受核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of NF-κB ligand,RANKL）调控。目前研究发现,1α,25-（OH）2D3不仅能宏观上调节动物对钙、磷的吸收,还能直接作用于成骨细胞,通过RANKL/RANK/OPG系统调节骨代谢,亦有认为1α,25-（OH）2D3能直接作用于OC,但报道很少。RANKL的表达和分泌诱导单核巨噬细胞形成OC。因此进一步理解维生素D对骨细胞调节的确切机制有助于更好地防治代谢性骨病。本文以破骨细胞前体细胞RAW264.7小鼠单核巨噬细胞株作为研究对象,探讨了不同培养条件方法对细胞生物学特性的影响。并在此基础上研究了不同浓度RANKL（25.50.100ng/ml）.1α,25-（OH）2D3（1×10-9、1×10-8、1×10-7mol/L）对细胞增殖的影响,以及1α,25-（OH）2D3对RAW264.7细胞分化形成OC及对骨吸收活力的影响,为1α,25-（OH）2D3治疗骨代谢性疾病提供理论性的依据。取得如下结果：（1）优化了RAW264.7细胞培养方法。传统消化法约需10～15min才能使细胞消化下来,而改良的消化方法只需3～5min就可以使细胞消化下来,降低了胰酶对细胞的损伤。改良方法中细胞贴壁快,形态良好,增殖迅速。慢速冻存法复苏后细胞的成活率（88.7%）极显著高于快速冻存法（81.8%）（P<0.01）。说明两次胰酶消化法及慢速冻存法更适合RAW264.7细胞生长,细胞状态良好。（2）不同浓度的RANKL均可抑制RAW264.7细胞增殖,且随着浓度增加,抑制作用增强。培养3d,100ng/ml RANKL组细胞增殖率极显著低于对照组（P<0.01）。培养4d时,50及100ng/ml RANKL组细胞增殖率均极显著低于对照组（P<0.01）,并且TRAP阳性多核OC数极显著多于对照组和25ng/ml RANKL组（P<0.01）,各浓度RANKL组象牙片均出现明显吸收陷窝。各浓度1α,25-（OH）2D3均促进RAW264.7细胞增殖,且随1α,25-（OH）2D3浓度增加,促进作用增强。培养3d,1×10-9、1×10-8、1×10-7mol/L1α,25-（OH）2D3组细胞增殖率均极显著高于对照组（P<0.01）,并且各浓度1α,25-（OH）2D3组较单独添加RANKL组TRAP阳性多核OC数增加,象牙片吸收陷窝更深。说明RANKL抑制细胞增殖,促进OC形成和活化,1α,25-（OH）2D3促进细胞增殖,并能增强RANKL对OC形成和吸收的诱导作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 符号说明
• 第一部分 文献综述
• 第一章 骨代谢
• 1 破骨细胞与成骨细胞及其主要功能
• 1.1 破骨细胞与成骨细胞的区别与联系
• 1.2 破骨细胞的主要功能
• 1.3 成骨细胞的功能
• 2 破骨细胞的生物学特性
• 2.1 破骨细胞的来源
• 2.2 破骨细胞的形态
• 2.3 破骨细胞的标志
• 2.4 破骨细胞的分化
• 3 OC溶解骨
• 3.1 骨无机质吸收
• 3.2 有机骨基质吸收
• 3.3 骨基质的运输与释放
• 4 OC与骨疾病
• 第二章 维生素D对骨骼的作用
• 1 维生素D的生物学特性
• 1.1 维生素D的来源与活性
• 1.2 维生素D的代谢
• 1.3 维生素D的受体
• 2 维生素D代谢产物对破骨细胞的效应
• 2.1 维生素D诱导OC生成
• 2.2 维生素D促进细胞因子的表达与分泌
• 3 维生素D调控骨代谢
• 3.1 维生素D对骨代谢的双向调控作用
• 3.2 维生素D对骨骼内钙、磷的影响
• 3.3 维生素D治疗骨病
• 第三章 RANKL/RANK/OPG与骨代谢
• 1 RANKL的生物学特性
• 1.1 RANKL的结构形式
• 1.2 RANKL的分布与表达
• 1.3 RANKL促进破骨细胞分化及活化
• 2 RANK的生物学特性
• 2.1 RANK的结构
• 2.2 RANK的分布与表达
• 2.3 RANK对破骨细胞的影响
• 3 RANKL/RANK/OPG联合作用于骨代谢
• 3.1 RANKL/RANK调控破骨细胞
• 3.2 RANKL/OPG调控骨代谢
• 4 RANKL/RANK/OPG应用于骨代谢疾病的治疗
• 4.1 靶向RANKL与RANK
• 4.2 RANKL-RANK信号传导途径
• 4.3 RANKL/RANK/OPG机制
• 参考文献
• 第二部分 研究内容
• 第一章 RAW264.7细胞的培养
• 1 材料
• 1.1 实验细胞
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 溶液的配制
• 2.2 RAW264.7细胞的传代培养
• 2.3 RAW264.7细胞的形态学观察
• 2.4 RAW264.7细胞的冻存与复苏
• 2.5 MTT法测定RAW264.7细胞的增殖情况
• 2.6 统计分析
• 3 结果
• 3.1 消化传代方法对消化时间的影响
• 3.2 培养不同时期细胞形态观察
• 3.3 冻存方法对细胞复苏后活率的影响
• 3.4 MTT法测定RAW264.7细胞活性
• 4 讨论
• 4.1 消化传代方法对消化时间的影响
• 4.2 冻存方法对细胞复苏后活率的影响
• 4.3 不同培养时间细胞的形态与增殖情况
• 2D₃对OC生成与活力的影响'>第二章 1α,25-（OH）₂D₃对OC生成与活力的影响
• 1 材料
• 1.1 实验细胞
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 溶液的配制
• 2D₃对细胞增殖的影响'>2.2 MTT法测不同浓度RANKL与1α,25-（OH）₂D₃对细胞增殖的影响
• 2.3 破骨细胞诱导培养
• 2.4 破骨细胞生长的形态学观察
• 2.5 破骨细胞染色及计数
• 2.6 象牙片吸收陷窝的检测
• 2.7 统计分析
• 3 结果
• 2D₃对细胞增殖的影响'>3.1 RANKL与1α,25-（OH）₂D₃对细胞增殖的影响
• 3.2 破骨细胞活体形态
• 3.3 破骨细胞的TRAP染色结果
• 3.4 象牙片吸收陷窝观测结果
• 4 讨论
• 2D₃对破骨前体细胞增殖的影响'>4.1 RANKL与1α,25-（OH）₂D₃对破骨前体细胞增殖的影响
• 4.2 RANKL对破骨细胞生成及活化的影响
• 2D₃对破骨细胞生成及活化的影响'>4.3 1α,25-（OH）₂D₃对破骨细胞生成及活化的影响
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢