荔枝TPEC高频率体胚发生及荔枝与龙眼原生质体融合研究

荔枝TPEC高频率体胚发生及荔枝与龙眼原生质体融合研究

论文摘要

本研究以荔枝转基因原生质体再生的胚性愈伤组织(Embryogenic callus derived fromtransgenic protoplasts,TPEC)细胞系为材料,优化荔枝TPEC长期继代保持的方法和条件;进行TPEC体胚发生的同步化调控,建立其高频率体胚发生的技术体系;通过POD和淀粉酶活性的测定,POD、EST同工酶酶谱变化分析,以及淀粉和可溶性总糖含量等生理指标测定,结合石蜡切片和透射电镜观察不同形态体胚的显微结构和超微结构等研究,进一步探讨荔枝TPEC体胚发生的机理;以荔枝TPEC细胞系中的Q81.535悬浮细胞为材料,优化荔枝TPEC高频率原生质体再生条件;并以荔枝TPEC细胞系中的Q81.535悬浮细胞和龙眼松散型胚性愈伤组织LC2为材料,采用PA-4000电融合仪进行荔枝与龙眼的原生质体融合的初步研究。主要研究结果如下:1.荔枝TPEC长期继代保持条件的优化与体胚发生的同步化调控。采用在MS附加1mg·L-12,4-D与附加1 mg·L-12,4-D+50 mg·L-1潮霉素(Hygromycin B)的2种培养基交替继代培养,20天继代一次,荔枝TPEC细胞系交替继代培养了2年,保持了其抗性和体胚发生能力,生长状态良好,且其体胚发生能力均高于对照。采用附加0.3 mg·L-12,4-D、20 g·L-1和1 mg·L-12,4-D、50g·L-1蔗糖的MS培养基对荔枝TPEC进行同步化调控,经在附加5 mg·L-1ZT高糖(50g·L-1)高琼脂(10 g·L-1)的MS培养基上进行体胚分化,体胚大小基本趋于一致,同步化程度高,荔枝TPEC体胚发生的频率得到了很大的提高,并且在附加1 mg·L-12,4-D、50g·L-1蔗糖的MS培养基的同步化调控的效果优于附加0.3 mg·L-12,4-D、20 g·L-1蔗糖。2.激素、渗透压调节物、天然附加物等对荔枝TPEC体胚发生及其成熟的影响。不同浓度的细胞分裂素(ZT、KT、6-BA)对荔枝TPEC体胚发生的影响存在差异,其对体胚发生所起作用的顺序为ZT>KT>6-BA。并确定荔枝体胚高频率发生的适宜培养基为附加3.0 mg·L-1ZT、附加50 g·L-1蔗糖、10 mg·L-1琼脂、100 mg·L-1肌醇;pH为5.8的MS培养基。在此培养基上体胚发生频率为100%,早期白色正常胚的比例达82%,个体较大,多为正常子叶胚;椰乳和龙眼汁对荔枝TPEC体胚的成熟有促进作用,其体胚正常成熟率分别为48.3%和45.6%;而ABA、BA、PEG均不利于荔枝TPEC体胚成熟,其体胚正常成熟率最高的达17.4%。3.荔枝TPEC体胚发生机理的研究。①荔枝TPEC长期继代保持、体胚发生及其成熟过程中相关酶活性的研究。荔枝TPEC长期继代、体胚发生及其成熟过程中,POD活性总体呈下降趋势,分别在球形胚阶段和在成熟培养15天时出现两个峰值,且球形胚的POD活性最强;淀粉酶活性较低,α-淀粉酶与β-淀粉酶活性变化总体变化趋势都呈双峰型,但其峰值出现的时间不同;在不同细胞系之间,荔枝TPEC的4个细胞系的POD活性均高于对照;α-淀粉酶的活性低于对照,而β淀粉酶的活性高于对照。早期白色子叶胚与玻璃化胚、正常成熟与提早生根的成熟体胚之间POD和淀粉酶的活性也存在差异。②采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对荔枝TPEC继代、体胚发生及其成熟过程中POD与EST同工酶酶谱进行分析。荔枝TPEC不同细胞系之间、不同形态以及不同成熟时间的体胚的POD同工酶谱带既有酶带强弱的差异,又有带数的增减;EST同工酶具有稳定性,不同细胞系之间EST同工酶酶谱只有强弱的差异,没有谱带的变化,而在体胚发生及其成熟过程中EST同工酶出现两条新的谱带,其变化是相对稳定的,酯酶同工酶谱带条数不存在差异,只是表达量上的不同。③研究了荔枝TPEC体胚发生及其成熟过程中总糖和淀粉含量的变化。荔枝TPEC体胚发生和成熟过程中可溶性总糖含量的变化呈双峰型变化,峰值分别出现在球形胚阶段和成熟30 d;淀粉含量的变化趋势呈三峰型,峰值分别在球形胚、成熟培养15 d和60 d;早期白色子叶胚和玻璃化胚之间、提早生根与正常的成熟体胚之间可溶性总糖和淀粉的含量均存在差异。④采用石蜡和超薄切片的方法对荔枝TPEC体胚的显微和超微结构进行了研究。不同阶段、不同形态体胚的显微和超微结构均存在差异。荔枝TPEC早期白色子叶胚和正常成熟的体胚的细胞超微结构的特征是细胞形状比较规则,大小均匀,细胞内含物丰富;玻璃化子叶胚和提早生根的成熟胚细胞较大,细胞壁较薄,液泡很大,细胞核小,有核仁存在,核质较浓;细胞内含物较少。4.荔枝与龙眼原生质体融合及其产物初步培养研究。荔枝TPEC细胞系Q81.535悬浮细胞系原生质体分离的适宜条件是:在不含潮霉素的交替继代培养基上悬浮培养6-8代的第5 d的悬浮细胞,用含纤维素和离析酶各1%的CPW-13M酶解液,在黑暗、25+2℃条件下,采用连续振荡(30-40 r·min-1)酶解10 h。在此条件下,荔枝TPEC原生质体产量最高达10.8×107个/g,活力最高达95.3%;以改良KM8P培养基中附加1.0 mg·L-12,4-D、0.2 mg·L-1NAA、0.5 mg·L-1BA、0.5 mg·L-1KT、50 mL·L-1椰汁、250 mg·L-1谷氨酰胺、0.45 M葡萄糖和0.1 M蔗糖为培养基,采用海藻酸钠盐包埋悬浮方式黑暗培养,使得高频率原生质体再生;以荔枝TPEC中细胞系Q81.535悬浮细胞和龙眼松散型胚性愈伤组织LC2为材料,采用PA-4000电融合仪进行荔枝龙眼原生质体融合的适宜条件是当原生质体密度为5×105个·mL-1时,选用交流电场的频率为1.0 Mhz、交变电场场强为50 V·cm-1,作用时间为60 s,直流脉冲强度为600 V·cm-1、脉冲持续时间为10 ms,脉冲2-3次,融合率可达30%以上。其电融合产物以改良KM8P为基本培养基,附加1.0 mg·L-12,4—D、0.2 mg·L-1NAA、0.5mg·L-1BA、0.5 mg·L-1KT、50 mL·L-1CW、250 mg·L-1谷氨酰胺、0.45 M葡萄糖和0.1 M蔗糖进行初步培养,形成多细胞团,植板率达12.5%。该研究为创造龙眼或荔枝的新种质、新品种或新型的水果提供了技术平台。

论文目录

  • 目录
  • 缩写词
  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 引言
  • 1 问题的提出
  • 2 植物体细胞胚胎发生的研究进展
  • 2.1 植物体胚发生的途径与细胞学形态研究
  • 2.1.1 植物体胚发生的途径
  • 2.1.2 植物体胚发生的起源
  • 2.1.3 植物体胚发生的细胞学形态研究
  • 2.2 植物体胚发生过程中的生理生化变化的研究
  • 2.2.1 糖类物质的变化
  • 2.2.2 植物体胚发生过程中相关酶活性及其同工酶谱的变化
  • 2.3 植物体胚发生及成熟的影响因素
  • 2.3.1 植物体胚发生的影响因素
  • 2.3.2 植物体胚成熟的影响因素
  • 3 植物原生质体培养与融合研究进展
  • 3.1 植物原生质体培养研究进展
  • 3.1.1 植物原生质体培养及再生植株研究进展
  • 3.1.2 影响原生质体分离与培养的因素
  • 3.2 植物原生质体融合研究进展
  • 3.2.1 建立高效的原生质体再生体系
  • 3.2.2 采用合适的诱导融合方法
  • 3.2.3 开发不对称融合系统
  • 3.2.4 设计有效的杂种筛选系统
  • 3.2.5 采用快速准确的杂种鉴定技术
  • 4 荔枝、龙眼生物技术研究进展
  • 4.1 荔枝生物技术研究进展
  • 4.2 龙眼生物技术研究进展
  • 4.3 荔枝、龙眼生物技术中存在的问题
  • 4.3.1 荔枝龙眼体胚发生研究中主要存在的问题
  • 4.3.2 龙眼荔枝原生质体融合主要存在问题
  • 5 本研究的主要内容及意义
  • 第二章 荔枝TPEC高频率体胚发生系统优化
  • 第一节 荔枝TPEC的继代保持与体胚发生的同步化调控
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 荔枝TPEC的继代保持及体胚发生能力检测
  • 1.2.2 荔枝TPEC高度同步化培养物的培养
  • 2 结果与分析
  • 2.1 荔枝TPEC的继代与保持
  • 2.2 荔枝TPEC的体胚发生能力的检测
  • 2.3 不同培养基的同步化调控对荔枝TPEC体胚诱导的影响
  • 3 讨论
  • 3.1 荔枝TPEC长期继代保持的关键技术
  • 3.2 同步化调控可以提高荔枝TPEC体胚发生的频率
  • 第二节 荔枝TPEC高频率体胚发生体系的建立
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 不同植物生长调节剂对体胚诱导的影响
  • 1.2.2 荔枝TPEC不同细胞系之间体胚发生能力的比较
  • 2 结果与分析
  • 2.1 激素种类及浓度对荔枝TPEC体胚发生的影响
  • 2.1.1 NAA对荔枝TPEC体胚发生的影响
  • 2.1.2 细胞分裂素对荔枝TPEC体胚发生的影响
  • 2.2 荔枝TPEC不同细胞系之间体胚发生的差异
  • 3 讨论
  • 3.1 荔枝TPEC体胚高频率发生关键技术
  • 3.2 原生质体操作促进荔枝抗性胚性愈伤组织体胚高频率发生
  • 第三节 荔枝TPEC体胚成熟培养及植株再生
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 荔枝体胚成熟与萌发
  • 1.2.2 荔枝TPEC体胚再生植株
  • 2 结果与分析
  • 2.1 不同附加物对荔枝TPEC体胚成熟的影响
  • 2.1.1 有机附加物对荔枝TPEC体胚成熟的影响
  • 2.1.2 BA对荔枝TPEC体胚成熟的影响
  • 2.1.3 ABA对荔枝TPEC体胚成熟的影响
  • 2.1.4 PEG对荔枝TPEC体胚成熟的影响
  • 2.1.5 附加物对荔枝TPEC体胚成熟的共同影响
  • 2.2 荔枝TPEC体胚再生植株
  • 3 讨论
  • 3.1 不同附加物与荔枝TPEC体胚成熟的关系
  • 3.2 提高荔枝TPEC体胚成苗率的关键技术
  • 3.3 建立荔枝TPEC高频率体胚发生体系的意义
  • 第三章 荔枝TPEC继代、体胚发生及成熟过程中的生理生化机制研究
  • 第一节 荔枝TPEC继代、体胚发生和成熟过程中相关酶活性变化
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 材料处理方法与取材
  • 1.2.2 酶活性测定的方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 荔枝TPEC长期继代、体胚发生及体胚成熟过程中POD活性的变化
  • 2.1.1 荔枝TPEC细胞系继代过程中POD酶促反应速率及POD活性的变化
  • 2.1.2 荔枝TPEC经同步化调控培养物之间POD酶促反应速率与活性的差异
  • 2.1.3 荔枝TPEC早期白色子叶胚与玻璃化体胚之间POD酶促反应速率和活性的差异
  • 2.1.4 荔枝TPEC体胚发生及正常成熟过程中POD活性的变化
  • 2.1.5 荔枝TPEC体胚成熟过程中正常与提早生根成熟胚的POD活性的比较
  • 2.2 荔枝TPEC长期继代、体胚发生与成熟过程中淀粉酶活性的变化
  • 2.2.1 荔枝TPEC长期继代过程中淀粉酶活性的变化
  • 2.2.2 荔枝TPEC经同步化调控后培养物之间淀粉酶活性的差异
  • 2.2.3 荔枝TPEC早期白色子叶胚与玻璃化体胚之间淀粉酶活性的差异
  • 2.2.4 荔枝TPEC体胚发生及成熟过程中淀粉酶活性的变化
  • 2.2.5 荔枝TPEC体胚成熟过程中正常与提早生根胚的淀粉酶活性变化的比较
  • 3 讨论
  • 3.1 POD活性与荔枝TPEC长期继代、体胚发生和成熟的关系
  • 3.2 淀粉酶活性与荔枝TPEC长期继代、体胚发生及成熟的关系
  • 第二节 荔枝TPEC继代、体胚发生及成熟过程中相关同工酶分析
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 材料处理方法与取材
  • 1.2.2 同工酶酶液提取
  • 1.2.3 同工酶电泳
  • 1.2.4 同工酶染色方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 荔枝TPEC长期继代、体胚发生和体胚成熟过程中POD同工酶酶谱分析
  • 2.1.1 不同荔枝TPEC细胞系继代过程中POD同工酶酶谱分析
  • 2.1.2 荔枝TPEC体胚发生和体胚成熟过程中POD同工酶酶谱分析
  • 2.2 荔枝TPEC继代、体胚发生和体胚成熟过程中EST同工酶酶谱分析
  • 2.2.1 染色方法对荔枝EST同工酶谱带的影响
  • 2.2.2 荔枝TPEC长期继代过程中EST同工酶酶谱分析
  • 2.2.3 荔枝TPEC体胚发生和体胚成熟过程中EST同工酶酶谱分析
  • 3.讨论
  • 3.1 过氧化物酶同工酶与荔枝TPEC继代、体胚发生及体胚成熟的关系
  • 3.2 酯酶同工酶与荔枝TPEC继代、体胚发生及体胚成熟的关系
  • 第三节 荔枝TPEC体胚发生及成熟过程中总糖含量的变化
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 可溶性总糖的提取
  • 1.2.2 可溶性总糖含量的计算
  • 1.2.3 总糖标准曲线绘制
  • 2 结果与分析
  • 2.1 可溶性总糖标准曲线
  • 2.2 荔枝TPEC体胚发生及成熟过程中可溶性总糖含量的变化
  • 2.3 荔枝TPEC早期白色子叶胚与玻璃化体胚之间总糖含量的比较
  • 2.4 荔枝TPEC成熟过程中正常与提早生根体胚之间总糖量的差异
  • 3 讨论
  • 3.1 总糖含量与荔枝TPEC体胚发生及其成熟的关系
  • 3.2 总糖对荔枝TPEC体胚发生形态的影响
  • 第四节 荔枝TPEC体胚发生及成熟过程中淀粉含量的变化
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 淀粉的提取
  • 1.2.2 淀粉含量测定
  • 1.2.3 样品中淀粉含量的计算
  • 2 结果与分析
  • 2.1 荔枝TPEC体胚发生和正常成熟过程中淀粉含量的变化
  • 2.2 荔枝TPEC成熟过程中正常与提早生根体胚之间淀粉含量的差异
  • 3 讨论
  • 3.1 淀粉含量的变化与荔枝TPEC体胚成熟的关系
  • 3.2 淀粉含量的变化与荔枝TPEC成熟过程中提早生根的关系
  • 第四章 荔枝TPEC体胚的显微与超微结构观察
  • 第一节 荔枝TPEC体胚的细胞组织学观察
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 材料处理方法
  • 1.2.2 石蜡切片制作方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 荔枝TPEC早期白色子叶胚的细胞组织学特征
  • 2.2 荔枝TPEC玻璃化子叶胚的细胞组织学特征
  • 2.3 荔枝TPEC正常成熟体胚的细胞组织学特征
  • 3 讨论
  • 3.1 荔枝TPEC体胚发生的细胞组织学变化
  • 3.2 荔枝TPEC早期白色子叶体胚与玻璃化胚之间细胞组织学差异
  • 3.3 荔枝TPEC体胚中淀粉粒的动态变化
  • 第二节 荔枝TPEC体细胞胚胎的超微结构观察
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 取样与前固定
  • 1.2.2 清洗
  • 1.2.3 后固定
  • 1.2.4 清洗
  • 1.2.5 脱水
  • 1.2.6 渗透
  • 1.2.7 包埋
  • 1.2.8 聚合
  • 1.2.9 制备超薄切片
  • 1.2.10 染色
  • 1.2.11 透射电镜下观察拍照
  • 2 结果与分析
  • 2.1 荔枝TPEC早期白色子叶胚的超微结构观察
  • 2.2 荔枝TPEC玻璃化胚的超微结构观察
  • 2.3 荔枝TPEC成熟体胚的超微结构观察
  • 3 讨论
  • 3.1 荔枝TPEC正常体胚的细胞超微结构特征
  • 3.2 荔枝TPEC不同形态体胚之间细胞超微结构的差异
  • 第五章 荔枝与龙眼原生质体电融合及初步培养
  • 第一节 荔枝TPEC原生质体分离条件的优化
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 荔枝TPEC继代与保持
  • 1.2.2 荔枝TPEC悬浮细胞系的建立
  • 1.2.3 荔枝TPEC原生质体分离与纯化
  • 1.2.4 原生质体活力测定
  • 1.2.5 原生质体培养
  • 2 结果与分析
  • 2.1 培养方式对荔枝TPEC原生质体分离的影响
  • 2.2 悬浮培养时间对荔枝TPEC原生质体分离的影响
  • 2.3 继代代数和交替培养基对原生质体分离的影响
  • 2.4 荔枝TPEC原生质体培养
  • 3 讨论
  • 3.1 荔枝TPEC原生质体分离材料与其产量和活力的关系
  • 3.2 荔枝TPEC悬浮细胞原生质体分离的适宜条件
  • 第二节 荔枝、龙眼原生质体电融合适宜条件的研究
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 龙眼、荔枝胚性愈伤组织的继代与保持
  • 1.2.2 荔枝TPEC悬浮细胞系的建立
  • 1.2.3 原生质体分离
  • 1.2.4 原生质体纯化
  • 1.2.5 荔枝、龙眼原生质体电融合
  • 2 结果与分析
  • 2.1 融合过程描述
  • 2.2 交流电场(AC)对原生质体成串的影响
  • 2.2.1 交变电场频率对原生质体成串的影响
  • 2.2.2 交变电场强度对原生质体成串的影响
  • 2.2.3 交变电场作用时间对原生质体成串的影响
  • 2.3 直流脉冲(DC)对原生质体融合的影响
  • 2.3.1 直流脉冲强度对原生质体融合的影响
  • 2.3.2 直流脉冲时间对原生质体融合率的影响
  • 2.3.3 直流脉冲次数对原生质体融合的影响
  • 2.4 原生质体密度对融合率的影响
  • 3 讨论
  • 3.1 荔枝、龙眼原生质体电融合的适宜参数
  • 3.2 PA-4000电融合仪在龙眼、荔枝原生质体融合中的应用
  • 第三节 荔枝与龙眼电融合产物的初步培养
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 基本培养基的筛选
  • 1.2.2 荔枝与龙眼电融合产物培养
  • 1.2.3 植板率的计算
  • 2 结果与分析
  • 2.1 荔枝、龙眼原生质体融合产物培养过程观察
  • 2.2 基本培养基对荔枝、龙眼原生质体融合产物早期培养的影响
  • 3 讨论
  • 3.1 荔枝与龙眼原生质体融合产物培养技术
  • 3.2 荔枝、龙眼原生质体融合对植物品种改良的意义
  • 第六章 小结
  • 1 荔枝TPEC高频率体胚发生体系的建立
  • 2 荔枝TPEC体胚发生机理的研究
  • 3 荔枝与龙眼原生质体融合及其产物初步培养
  • 参考文献
  • 图版说明
  • 图版
  • 在学期间参加学术活动和发表相关论著
  • 致谢
  • 相关论文文献

    • [1].荔枝TPEC与龙眼EC的电融合参数研究[J]. 福建农林大学学报(自然科学版) 2014(04)

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